Optimización de un procedimiento de secuenciación de nueva generación de amplicones cortos para la identificación de alelos de riesgo de enfermedad celíaca e intolerancia a la lactosa.

Abstract

[ES] Las intolerancias alimentarias son relativamente frecuentes en la población adulta e infantil, siendo las intolerancias al gluten (celiaquía o enfermedad celíaca (EC)) y a la lactosa (no persistencia de la lactasa) las más frecuentes. Existe muy poca información sobre su prevalencia individual y conjunta, tanto en población europea como en España, en particular, debido a que su diagnóstico sigue siendo en muchos casos todo un desafío. Los individuos afectados presentan, en ambos casos, signos y síntomas comunes con otras patologías, dificultando su identificación precisa. Resulta, por tanto, muy interesante estudiar los marcadores genéticos de riesgo descritos para ambas intolerancias en población española, para lo cual la tecnología de Secuenciación de Nueva Generación (NGS) se presenta como una opción altamente ventajosa, al ofrecer una gran resolución, sensibilidad y eficiencia en la identificación de variantes genéticas, incluso en regiones complejas o hipervariables. Se conoce que la presencia de determinados haplotipos de los genes DQA1 y DQB1 del sistema HLA confieren riesgo de desarrollar EC, y que 5 SNPs de la zona 5’ del gen LCT (codificante de la lactasa) confieren riesgo de desarrollar intolerancia a la lactosa. Por consiguiente, el análisis de estos alelos resulta fundamental para poder estudiar su frecuencia y la implicación de cada uno de ellos en sus respectivas intolerancias y posible interacción. El análisis de amplicones cortos mediante la tecnología de Secuenciación de Nueva Generación (NGS) se presenta como una buena opción para llevar a cabo este tipo de estudios. Por esta razón, el presente trabajo experimental tiene como objetivo principal la optimización de un procedimiento de NGS por amplicones cortos para la identificación de los alelos descritos en literatura científica como alelos de riesgo para EC e intolerancia a la lactosa. Para ello, se procede al diseño de cebadores específicos que permitan amplificar las regiones de interés de los genes LCT, HLA-DQA1 y HLA-DQB1 para su posterior secuenciación. Con el propósito de obtener una cobertura homogénea para todos los fragmentos amplificados, resulta necesario optimizar las condiciones de generación de librerías. Para ello, se realizan diversas pruebas utilizando diferentes combinaciones de cebadores, concentraciones y aditivos, determinando, a partir de los resultados obtenidos, las condiciones óptimas que permiten la correcta identificación de las variantes de interés. De este modo, la secuenciación masiva de amplicones cortos ha demostrado ser una herramienta altamente eficiente para la detección de variantes alélicas de riesgo en las patologías estudiadas, pudiendo en un futuro implantarse en el ámbito clínico, brindando resultados que faciliten un preciso diagnóstico. Este trabajo se relaciona con los siguientes ODS de la Agenda 2030: Salud y Bienestar (ODS 3) y, en menor medida, con Hambre Cero (ODS 2) y Reducción de las Desigualdades (ODS 10).

[EN] Food intolerances are relatively common in both adults and children population, being gluten intolerance (celiac disease (CD)) and lactose intolerance (lactase non-persistence) the most frequent. There is very little information on the individual and combined prevalence of these intolerances, both in the European population and particularly in Spain. Their diagnosis remains challenging in many cases. Affected individuals present, in both cases, common signs and symptoms that overlap with other pathologies, making their accurate identification difficult. It is therefore very interesting to study the genetic risk markers described for both intolerances in the Spanish population, for which the New Generation Sequencing (NGS) technology is presented as a highly advantageous option, as it offers high resolution, sensitivity, and efficiency in the identification of genetic variants, even in complex or hypervariable regions. It is known that the presence of certain haplotypes of the DQA1 and DQB1 genes of the HLA system confer a risk of developing CD, and that 5 SNPs in the 5' zone of the LCT gene (coding for lactase) confer a risk of developing lactose intolerance. Therefore, the analysis of these alleles is essential to study their frequency and their association with their respective intolerances, as well as possible interactions. The utilization of New Generation Sequencing (NGS) technology for analyzing short amplicons is presented as a good option for conducting such studies. For this reason, the aim of this experimental study is to optimize an NGS protocol using short amplicons for the identification of alleles described in scientific literature as risk alleles for CD and lactose intolerance. To achieve this, specific primers are designed to amplify the target regions of the LCT, HLA-DQA1 and HLA-DQB1 genes for subsequent sequencing analysis. To obtain a homogeneous coverage for amplified fragments, it is essential to optimize the conditions for library generation. To accomplish this, multiple tests are conducted, employing different combinations of primers, concentrations, and additives. Based on the obtained results, the optimal conditions are determined, ensuring accurate identification of the targeted variants of interest. In this way, the utilization of high-throughput sequencing of short amplicons has proven to be a highly efficient tool for detecting risk allelic variants in the studied pathologies. This approach holds potential for future implementation in the clinical setting, providing results that facilitate an accurate and precise diagnosis. This work is related to the following SDGs of the 2030 Agenda: Health and Well-being (SDG 3) and, to a lesser extent, Zero Hunger (SDG 2) and Reduction of Inequalities (SDG 10).