Manejo de técnicas de biopsia líquida, generación de organoides y estudio de nuevas terapias en cáncer colorrectal

Abstract

[ES] El cáncer colorrectal (CCR) representa una carga significativa para la salud pública, siendo la segunda causa principal de muertes por cancer a nivel global, de acuerdo con la Organización Mundial de la Salud. Según diversas estadísticas, hay entre un 30 y 40% de pacientes que sufren recaída tras el tratamiento. En la actualidad, se emplean biomarcadores moleculares como la inestabilidad de microsatélites (MSI), mutaciones en BRAF/RAS o amplificaciones en HER2 para ofrecer opciones adicionales a los pacientes que experimentan recaídas. Se están explorando nuevos biomarcadores con la intención de transformar el pronóstico y facilitar terapias específicas. Entre estos, la biopsia líquida emerge como un método no invasivo en crecimiento, capaz de detectar mutaciones específicas en el ADN circulante tumoral (ADNct). Focalizando el estudio en un biomarcador concreto, se investiga la expresión del gen Caudal-related Homeobox 2 (CDX2), que codifica un factor de transcripción que regula la actividad de genes relacionados con el desarrollo y la diferenciación celular intestinal. Este gen es un biomarcador crucial ya que normalmente se expresa en las células del colon. Se ha observado que la pérdida de su expresión se correlaciona con un peor pronóstico en casos específicos de cáncer colorrectal. Esta pérdida compromete su función natural, perturbando la diferenciación celular y promoviendo así la progresión tumoral y la metástasis. Asimismo, la disminución de CDX2 se ha asociado con la resistencia a ciertos regímenes de quimioterapia, lo que resulta en un pronóstico menos favorable para los pacientes afectados. Por lo tanto, el uso de CDX2 como biomarcador podría desempeñar un papel crucial en la individualización del tratamiento, permitiendo una selección más precisa de terapias basadas en las características de cada paciente. Esto incluye la capacidad de anticipar la eficacia de tratamientos como la quimioterapia y determinar si su aplicación sería beneficiosa en pacientes con un alto riesgo de recurrencia. Sin embargo, la clasificación de los pacientes con CCR según la presencia o ausencia del gen CDX2 se ve dificultada por la variabilidad en su expresión dentro del tumor. El objetivo principal de este estudio es, en primer lugar, establecer un modelo de organoides desde cero, como modelo de estudio del estado del gen CDX2 y su reversión de expresión utilizando la tecnología de CRISPR/dCAS9, que implica la fusión de dominios catalíticos de TET y DNMT. Posteriormente, se procederá con la validación de la expresión de CDX2 en todos los modelos (basales y editados) tanto a nivel de ARNm, mediante qPCR, como a nivel de proteína, mediante Western Blot. Además, se ha llevado a cabo un cribado farmacológico en los organoides de pacientes con presencia y ausencia de CDX2, utilizando algunos de los fármacos empleados en la práctica clínica del cáncer de colon, con el fin de observar diferencias en las respuestas. Los resultados obtenidos en este trabajo reafirman las hipótesis planteadas sobre la relación entre CDX2 y la resistencia a la quimioterapia, demostrando que una reversión en la expresión de CDX2 en los organoides modelo implica un cambio en la respuesta a la quimioterapia.

[EN] Colorectal cancer (CRC) represents a significant public health burden, being the second leading cause of cancer deaths globally, according to the World Health Organization (WHO). Several statistics indicate that between 30 and 40% of patients experience a relapse after treatment. Currently, molecular biomarkers such as microsatellite instability (MSI), BRAF/RAS mutations, or HER2 amplifications are used to provide additional options for patients experiencing relapses. New biomarkers are being explored with the aim of transforming prognosis and facilitating targeted therapies. Among these, liquid biopsy is emerging as a growing non-invasive method capable of detecting specific mutations in circulating tumor DNA (ctDNA). Focusing the study on a specific biomarker, it is being investigated the expression of the Caudal-related Homeobox 2 (CDX2) gene, which encodes a transcription factor that regulates the activity of genes related to intestinal cell development and differentiation. This gene is a crucial biomarker as it is normally expressed in colon cells. It has been observed that the loss of its expression correlates with a poorer prognosis in specific cases of colorectal cancer. This loss compromises its natural function, disrupting cell differentiation and thus promoting tumour progression and metastasis. Moreover, the reduction of CDX2 has been associated with resistance to certain chemotherapy regimens, resulting in a less favourable prognosis for affected patients. Therefore, the use of CDX2 as a biomarker could play a crucial role in the individualization of treatment, allowing for a more precise selection of therapies based on the characteristics of each patient. This includes the ability to anticipate the efficacy of treatments such as chemotherapy and determine whether its application would be beneficial in patients at high risk of recurrence. However, the classification of CRC patients according to the presence or absence of the CDX2 gene is complicated by the variability in its expression within the tumour. The main objective of this study is, first, to establish an organoid model from scratch, as a study model of the CDX2 gene status and its expression reversion using CRISPR/dCAS9 technology, which involves the fusion of catalytic domains of TET and DNMT. Subsequently, CDX2 expression will be validated in all models (basal and reverted) at both the mRNA level, using qPCR, and at the protein level, using Western Blot. In addition, a pharmacological screening has been carried out in patient-derived organoids with and without CDX2, using some of the drugs employed in clinical practice for colon cancer, to observe differences in responses. The results obtained in this study reaffirm the hypotheses presented on the relationship between CDX2 and chemotherapy resistance, demonstrating that a reversal in CDX2 expression in model organoids also implies a change in the response to chemotherapy.