Vitrificación de embriones de conejo de 8-16 células en medios con etilenglicol y dextrano

Abstract

[EN] Vitrification of early stage embryos (from pronucleus to 16-cell embryos) is still a challenge. These embryonic development stages show a high sensibility to rapid cooling rates, osmotic stress and the high concentrations of cryoprotectants required for the vitrification process. The aim of this work was to define a low toxicity vitrification solution containing ethylene glycol, dextran and sucrose as well as the carrier system for the cryoconservation of 8-16-cell rabbit embryos. In addition to evaluating the postvitrification survival of embryos cultured in vitro for 72 hours and studying the expression level of OCT4, SOX2 and NANOG pluripotency gene markers in the blastocysts obtained by culture. The 8-16-cell rabbit embryos were obtained from superovulated females treated intramuscularly with FSH, provided in 5 doses every 12 hours. Artificial insemination was performed 12 hours after the last injection. Between thirty-eight and forty hours after insemination, embryos were recovered by flushing the oviducts. Vitrification was carried out using three solutions containing 40% (v/v) ethylene glycol supplemented with different concentrations of dextran and sucrose, employing straws or CryoTops as the carrier system. After warming procedure, embryos were cultured in vitro for 72 hours up to the morulae or blastocyst stage. Embryo viability was assessed immediately after warming, in control group and vitrification groups which showed the highest rates of development to blastocyst stage using fluorescent vital staining. Relative expression of OCT4, SOX2 and NANOG genes was studied in blastocysts obtained by culture in these groups. Vitrification media supplemented with 18% (w/v) dextran and 0.3M sucrose gave the better rate of embryonic development in vitro. No significant differences were observed in expression levels of OCT4, SOX2 and NANOG genes between control and vitrified blastocysts

[ES] La vitrificación de estadios de desarrollo embrionario temprano (de pronúcleos a 16 células) es todavía un reto, ya que dichos estadios presentan mayor sensibilidad a la velocidad de descenso de la temperatura, al estrés osmótico y a las elevadas concentraciones de crioprotectores empleadas en las soluciones de vitrificación. Este estudio pretende definir tanto un medio de vitrificación de baja toxicidad con etilenglicol, dextrano y sacarosa como el soporte para la crioconservación de embriones de conejo de 8-16 células, evaluando la viabilidad in vitro de los embriones post-vitrificación tras 72 horas de cultivo y estudiando los niveles de expresión de los genes marcadores de pluripotencia OCT4, SOX2 y NANOG de los blastocistos obtenidos del cultivo. Los embriones de conejo de 8-16 células se obtuvieron a partir de hembras sometidas a un tratamiento de superovulación con FSH, administrado en 5 dosis cada 12 horas. A continuación, 12 horas después de la última dosis, las hembras fueron inseminadas y 38-40 horas más tarde se procedió a la recuperación de los embriones mediante la perfusión de los oviductos. El proceso de vitrificación se realizó empleando tres medios con un 40% de etilenglicol (v/v) y diferentes contenidos de dextrano y sacarosa y, dos soportes distintos (straw y CryoTop). Después de la desvitrificación, los embriones fueron cultivados in vitro durante 72 horas para su valoración, observando si alcanzaban los estadios de mórula y blastocisto. Por último, en los grupos control y de vitrificación con mejores ratios de desarrollo a blastocisto, se evaluó la viabilidad inmediata post-vitrificación mediante tinción vital fluorescente y se realizó un estudio de la expresión relativa de los genes OCT4, SOX2 y NANOG sobre los blastocisto obtenidos del cultivo. El medio de vitrificación con un 18% (p/v) de dextrano y 0’3M de sacarosa, proporcionó las mejores tasas de desarrollo embrionario in vitro. Por último, no se observaron diferencias significativas en los niveles de expresión de los genes OCT4, NANOG y SOX2 entre los blastocistos control y los vitrificados.