Identificación en levadura de genes determinantes de la tolerancia a ácidos preservantes de alimentos

Abstract

[EN] Intracellular pH (pHi)is a fundamental parameter in living cells because it regulates many processes, including cell growth and death. Proton and potassium transporters and their regulators, cellular buffers, metabolic reactions consuming and producing protons and cellular systems affected by changes in pHi constitute the pHi homeostasis system. To create intracellular acid stress in the laboratory we used weak organic acids such as acetic, that at pH 4-5 are to a large extent in undissociated state, and when introduced into the cell dissociate a proton causing a decrease in pHi. This intracellular acidification inhibits growth at low levels and induces cell death at high levels. These acids are used as food preservatives, because the presence of microorganisms such as bacteria or fungi alters their qualities, spoil them and may be harmful to consumers. Ramón Serrano’s laboratory is looking for new components involved in pHi homeostasis using the yeast model system and selecting mutants with increased tolerance to intracellular acid stress created by organic acids. This has identified the transport of leucine as a very sensitive system to acid pHi and protein kinase Gcn2 as activator of that transporter. The yeast system has a number of technical features that make it suitable for this type of biological tests. Yeast plasmids allow gain of function of genes from gene libraries to select yeast colonies with the phenotype of interest. In our case a higher tolerance to acetic acid is used. After selection of colonies and plasmid extraction and sequencing we can know which genes are present in the plasmid. These genes are responsible for the increased tolerance to acid stress. Employing this methodology I have isolated a plasmid from a yeast genomic library conferring an increased tolerance to acetic acid.

[ES] El pH intracelular (pHi) es un parámetro fundamental en las células, ya que regula muchos de los procesos que tienen lugar en ellas, incluyendo el crecimiento y la muerte celular. El pH intracelular, así como los sistemas celulares afectados por los cambios de este parámetro, están regulados por el sistema de homeostasis del pH. Tienen un papel importante los transportadores de protones, como la H+-ATPasa de membrana plasmática y sus reguladores. Para crear un estrés ácido en las células se emplean en el laboratorio ácidos orgánicos débiles como el acético, que en medios de pH 4-5 están en estado no disociado, y al difundir dentro de la célula se disocian provocando un descenso del pHi, inhibiendo su crecimiento y provocando muerte celular a altras concentraciones y pHi muy bajos. Por esta razón, se emplean como conservantes de alimentos, ya que la presencia de microorganismos como bacterias, hongos o levaduras alteran sus cualidades y pueden resultar dañinos para los consumidores. El laboratorio de Ramón Serrano está buscando nuevos componentes implicados en la homeostasis del pHi utilizando el sistema modelo de levadura y seleccionando mutantes con mayor tolerancia a estrés ácido intracelular. Ello ha permitido identificar el trandporte de leucina y la proteína kinasa Gcn2. El sistema de levadura presenta una serie de características técnicas que lo hacen indicado para este tipo de estudios biológicos. Se emplea el sistema de plásmidos que permiten conseguir una ganancia de función de genes para seleccionar las colonias de levadura según el fenotipo de interés, en nuestro caso una mayor tolerancia aácido acético. Tras la selección de los mutantes y la extracción del plásmido, mediante técnicas de secuenciación, se puede saber cuáles son los genes presentes en el plásmido, que serán los responsables de esta mayor tolerancia a estrés ácido. Empleando esta metodología se ha aislado un plásmido centromérico de la biblioteca genómica de levadura que confiere un aumento en la tolerancia ácido acético.