MicroRNAs reguladores de enzimas modificadoras de mt-tRNAs. ¿Firmas específicas o generales de enfermedades mitocondriales?

Abstract

[EN] The molecular mechanisms underlying human diseases, like MELAS and MERRF syndromes, are caused by mutations in mitochondrial (mt) tRNA genes, like mt-tRNALeu(UUR) and mt-tRNALys genes. These mutations are thought to exert their pathogenic role by hindering the modification of the uridine located at the anticodon wobble position (U34), leading to dysfunction of the oxidative phosphorylation system. Recently, it has being tested the hypothesis that regulation of the mt-tRNA modification enzymes may participate in the pathogenic mechanisms underlying these diseases. In fact, the wobble modification defects in MELAS are accompanied by an unexpected reduction in the steady-state levels of such enzymes. Since ROS is increased in MELAS cells and these species have been hypothesized to cause a microRNA-mediated response in mitochondrial disorders, it has being proved that the under-expression of the tRNA modifying enzymes in MELAS could be a consequence of a microRNA-directed regulation. An in silico analysis provided a group of microRNAs predicted to control the expression of mt-tRNA modifying proteins, eg. microRNA-9/9*.The overall goal of the submitted TFG project is to explore the role of other ROS-sensitive microRNAs in the expression of the mt-tRNA modifying proteins and to determine whether some of them construct specific signatures for each mitochondrial disease associated with mt-tRNA wobble modification defects. Thus, it is propose the following specific aims: -Perform a comparative analysis of the expression of predicted microRNAs in different cell lines carrying mutations in mt-tRNA genes and also compare the expression of the mttRNA modifying enzymes at transcriptional level by RT-qPCR. -Compare the expression of mt-tRNA modifying enzymes at translational level by immunoblotting assays. An overexpression of microRNAs miR-9/9*, miR-338 and miR-335 was observed, which was accompanied by the downregulation of their targets modifying enzymes. Furthermore, it could be possible to determine a differential pattern of microRNAs expression. Therefore, possible specific molecular signatures of these pathologies could be defined.

[ES] Los mecanismos moleculares causantes de algunas enfermedades, como el síndrome MELAS o MERRF, se deben a mutaciones en genes mitocondriales (mt) de tRNA, como los genes mt-tRNALeu(UUR) y mt-tRNALys. Se piensa que estas mutaciones dificultan la modificación de la uridina situada en la tercera posición del anticodón o posición tambaleante (U34) de estos mt-tRNAs, lo que conduce a la disfunción del sistema de fosforilación oxidativa y a la manifestación de la enfermedad. Recientemente, se ha puesto a prueba la hipótesis de que la regulación de las enzimas modificadoras de mt-tRNAs puede participar en los mecanismos patogénicos que subyacen a estas enfermedades. De hecho, el defecto en la modificacion de la posición tambaleante en MELAS se ve acompañado de una reducción inesperada en los niveles basales de ciertas enzimas modificadoras de mt-tRNAs. Debido a la elevada presencia de especies reactivas del oxígeno (ROS) en células MELAS y su papel en la activación de microRNAs reguladores transcripcionales, se ha podido relacionar la baja expresión de dichas enzimas modificadoras de mt-tRNAs con la regulación directa mediante estos microRNAs sensibles a ROS. Un estudio in silico ha previsto de un grupo de microRNAs candidatos a ser reguladores negativos post-transcripcionales de estas enzimas, como por ejemplo el microRNA-9/9*. El principal objetivo de este TFG es estudiar la implicación de los microRNAs sensibles a ROS en la expresión de las enzimas modificadoras de mt-tRNAs e identificar si la sobreexpresión de estos microRNAS constituye una firma específica para estas enfermedades mitocondriales. Para ello realizarán: - Análisis comparativos mediante RT-qPCR de la expresión de los microRNAs candidatos en distintas líneas celulares portadoras de mutaciones en genes mt-tRNAs y de la expresión de sus enzimas diana a nivel transcripcional. - Ensayos de inmunotransferencia para comparar los niveles de expresión de las enzimas a nivel traduccional. Tras los estudios realizados se observó la sobreexpresión de los microRNAs miR-9/9*, miR-338 y miR-335, lo cual venía acompañado de la reducción de la expresión de sus enzimas modificadoras diana. Además, se pudo establecer un patrón de expresión de microRNAs diferencial en cada línea celular, perfilándose así posibles firmas moleculares específicas de este tipo de patologías.