Puesta a punto de sistemas de detección de proteína c-reactiva (crp) mediante reconocimiento molecular. Estudio de prestaciones

Abstract

[ES] Según la OMS (Organización Mundial de la Salud), cerca de 17 millones de personas murieron en 2008 debido a enfermedades cardiovasculares (CVD) convirtiéndose en un problema serio para la salud pública. Debido a esto, muchos grupos de investigación centran sus esfuerzos en la caracterización de nuevos biomarcadores que permitan un diagnóstico rápido y fiable de las mismas. La proteína C-reactiva ha sido reconocida como uno de los biomarcadores de CVD y procesos inflamatorios. Así pues, dada su importancia clínica, actualmente es posible encontrar sistemas de detección de la misma en suero sanguíneo, principalmente mediante el inmunoensayo ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay). Sin embargo, las técnicas tradicionales presentan inconvenientes como la necesidad de grandes cantidades de muestra para el diagnóstico o tiempos de detección largos. Es por eso que tecnologías alternativas, como son los biosensores, van ganando terreno en el campo del diagnóstico clínico ya que sus prestaciones son cada día mayores. Con el presente trabajo se pretende poner a punto un sistema de detección para la proteína C-reactiva en formato microarray. Para ello, se analizan y comparan los distintos parámetros críticos que componen un microarray: 1) formato del biosensor (inmunoensayo competitivo directo o indirecto); 2) tipo de bioreceptor (anti-CRP monoclonal o policlonal o CRP); y 3) inmovilización del bioreceptor (pasiva o covalente). Con este fin, se llevaron a cabo distintos experimentos sobre superficies funcionalizadas con distintos organosilanos para añadir a la misma grupos vinil, tiol y flúor, que fueron empleados para inmovilizar el bioreceptor por adsorción en el caso de los grupos vinil y mediante enlace covalente con los grupos tiol en superficies mixtas compuestas con flúor y tiol. Así, se obtuvo un sistema de detección de la CRP dentro del intervalo de interés clínico (1-3 g/mL), con porcentajes de recuperación entre 70 y 136%, mediante inmunoensayo directo competitivo en formato microarray usando superficies de vidrio funcionalizadas con una mezcla 1:1 en volumen de 1H, 1H, 2H, 2H Perfluorodecyl-trietoxisilano 97% y 3-Mercaptopropyl trimetoxisilano 85%. Finalmente, en el trabajo se plantea una alternativa al inmunoensayo, basándonos en la capacidad de CRP para unirse específicamente a la fosforilcolina y se plantea la puesta a punto de un sistema donde dicha molécula actúe como bioreceptor en una superficie de resina SU-8.

[EN] According to the WHO (World Health Organization), around 17 million of people died in 2008 due to cardiovascular diseases (CDV), then, becoming a public health hazard. Due to this, many researching groups have already started to characterized new biomarkers or molecules present in the human fluids to diagnose CVDs in a reliable way. C-reactive protein is one of the already recognized biomarkers of CVD and inflammatory processes. Because of its clinic importance, it’s currently available detection system of it from human blood, mainly by ELISA immunoassay (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay). However, traditional techniques have some disadvantages such as the requirement of high sample amounts or long detection times. Biosensors overcome those problems, that is the reason why their design is gaining ground in the diagnostic field. Therefore, the main objective of this thesis is the development of a system for CRP detection. For that, different critical parameters regarding to microarray design are analyzed and compared: 1) Biosensor format (direct or indirect competitive immunoassay); 2) type of bioreceptor (monoclonal or polyclonal antibody); 3) bioreceptor immobilization (passively or covalently). Regarding to this, glass surfaces were functionalized with different organosilanes in order to add vinil, thiol and Fluor groups to it, that were used further to immobilized the bioreceptor by either adsorption (with vinil groups) or covalent bounds (with thiol groups in mixed surfaces with thiol and fluor). Finally, it was developed a detection system for CRP within clinical range (1-3 mg/mL), with a recovery percentage around 70 and 136%, through a direct competitive immunoassay in a microarray printed in glass surfaces previously functionalized with a mixture 1:1 (in volume) of 1H, 1H, 2H, 2H Perfluorodecyl-triethoxysilane 97% and 3-Mercaptopropyl trimethoxysilane 85%. In addition, we suggested an alternative to the immunoassay. So, based on the CRP capability to bind specifically phosphorylcholine (PC) is possible to optimize a new detection system in microarray format where PC is immobilized in a functionalized SU-8 surface.