Preparation of CENP-S/X and CENP-T/W complexes and probing the association of CENP-S/X with DNA and nucleosomes

Abstract

[EN] The repair of damaged DNA has important implications for genome stability and cancer. The DNA damage response (DDR) is a coordinated molecular process involving recruitment and activity of repair proteins on chromatin. An early step in this process is localisation of CENP-S and CENP-X proteins to the damage site by chromatin remodelling. Because these proteins are histone-like, we hypothesise that they form a looser nucleosome-related structure that could be acting as an intermediate scaffold enabling DNA repair. Therefore, obtaining recombinant CENP-S/X complex and performing specific DNA binding assays are essential to understand the context of DDR. In this project we will clone, express and purify recombinant human CENP-S and CENP-X as well as related CENP-T and CENP-W proteins. Then, we will perform experiments to observe the detailed binding of CENP-S/X on free DNA and nucleosome-loaded DNA, both by native polyacrylamide gel electrophoresis and by site directed hydroxyl radical mapping. This will enable us to model the arrangement of CENP-S/X on DNA and test the hypothesis that it contributes to chromatin-like structures, providing insight into the substrate on which the DDR acts.

[ES] La reparación del ADN dañado tiene importantes implicaciones para la estabilidad genomica y el cancer. La respuesta a daño en el ADN (DDR) es un proceso molecular coordinado que involucra el reclutamiento y la actividad de proteínas de reparación en la cromatina. Uno de los primeros pasos es la localización de las proteínas CENP-S y CENP-X en la zona del daño por remodelación de cromatina. Dado que estas proteínas son similares a histonas, hipotetizamos que forman una estructura similar a un nucleosoma y que podrían actuar como andamiaje para favorecer la reparación del ADN. Por lo tanto, obtener un complejo recombinante CENP-S/X y realizar ensayos de interacción con ADN son esenciales para comprender el context de la DDR.

En este proyecto clonaremos, expresaremos y purificaremos las proteinas CENP-S y CENP-X humanas ademas de las proteínas relacionadas CENP-T y CENP-W. Posteriormente realizaremos ensayos para analizar la union de CENP-S y CENP-X en ADN desnudo o recubierto de nucleosomas mediante electroforesis en geles nativos de poliacrilamida. y por mapeo dirigido de grupos hidroxilo. Esto nos permitirá modelar la disposición de CENP-S/X en el ADN y verificar la hipótesis de que contribuye a formar estructuras similares a cromatina, proporcionando información acerca del sustrato sobre el que la DDr actual.