Purificación, cristalización y caracterización de homólogos de IMPACT: una proteína implicada en control de la traducción en condiciones de estrés

Abstract

[ES] El objetivo del proyecto es estudiar y comprender el control de la expresión génica en células eucariotas en situaciones de estrés. La traducción es un complejo proceso que requiere un amplio número de factores para lograr la síntesis de una determinada proteína a partir de un mRNA transcrito. La traducción tiene lugar en tres fases, iniciación, elongación y terminación. Durante la fase de iniciación y bajo inanición aminoacídica, uno de los factores de participantes, elF2a, es fosforilado por Gcn2, provocando un cambio funcional de sustrato a inhibidor de dicho factor en el proceso. Así, aunque la síntesis general de proteínas se ve disminuida en estas condiciones, se produce un incremento en el flujo de específicos activadores transcripcionales que se encargan de mantener la homeostasis aminoacídica con la expresión de genes biosintéticos. Esto es llamado control general de aminoácidos, donde la escasez de uno de ellos estimula el incremento en la síntesis de los 20 amino ácidos. Gcn2 es activado ante múltiples estímulos de estrés, incluyendo inanición de amino ácidos, inanición de purinas, rayos UV, NO¿, toxicidad por sodio¿ Pero este estudio se centra en el primero, el mecanismo de activación de Gcn2 por la inanición aminoacídica. La presencia de niveles insuficientes de amino ácidos en la célula, incrementa la concentración celular de RNAt libre o no cargado que se une a Gcn2 provocando su activación. Por otra parte Gcn2 sufre numerosas modificaciones postraduccionales por diversas proteínas que modulan su interacción o afinidad de unión con RNAt. La capacidad de Gcn2 de activarse ante tal situación depende en gran medida de su interacción con Gcn1. Esta es una proteína de gran tamaño (297 kDa), y dada su similitud con el factor de elongación 3 (eEF3), se cree que dicha proteína actúa facilitando la transferencia de RNAt desde el ribosoma al dominio de unión de RNAt en Gcn2, activando su dominio kinasa. Sin la interacción con Gcn1, Gcn2 es incapaz de responder al incremento de niveles de RNAt no cargado. IMPACT es una proteína muy conservada en eucariotas que participa en el inicio de la traducción inhibiendo Gcn2 por competencia, secuestrando a su ligando celular Gcn1. Yih1 es el ortólogo de IMPACT en levadura. Yih1 posee dos dominios, N-terminal RWD y un dominio C-terminal, llamado Antiguo y muy conservado en todos los niveles de seres vivos. Esta gran conservación de este dominio a lo largo de la evolución, así como es caso de IMPACT en eucariotas, indica que este debe jugar un papel de gran importancia en la célula. Aunque Gcn2 y Yih1 no parecen compartir una elevada homología de tu completa secuencia, las regiones de Gcn2 importantes en la interacción con Gcn1 son similares a las de Yih1. Ha sido previamente demostrado que Yih1 es capaz de interaccionar con Gcn1 en la misma zona que Gcn2, se manera que se propone la función de Yih1 como un regulador negativo de Gcn2, compitiendo con la interacción entre Gcn2 y Gcn1. De esta forma este dominio C-terminal o Antiguo parece tener un papel regulador modulando la interacción Yih1-Gcn1, lo que tiene un efecto directo en la modulación de la activación de Gcn2. Yih es capaz de interaccionar con una gran variedad de proteínas dentro de la célula, así como de manera específica con Gcn1, siendo ésta la que de alguna forma reduce o regula la activación de Gcn2, pudiendo ocurrir que Yih1 se encuentre secuestrada de en condiciones normales, o que solo sea capaz de interaccionar con Gcn1 al alcanzar una determinada concentración. En condiciones normales Yih1 se encuentra en estado inactivado para esta interacción, ya que se encuentra interaccionando con actina globular. De esta forma, ante la liberación de Yih1 de su interacción con actina, se previene de alguna forma la interrupción total en la síntesis de amino ácidos y se proporciona una constante síntesis a nivel basal de amino ácidos.

[EN] Translation is the second stage of the process that allows the protein synthesis in living beings. It is a complex biological process carried out by the ribosome, in which all cells and all organisms are depending on, and where the conversion of the information contained in the messenger RNA (mRNA) is produced. Translation takes place in three phases, initiation, elongation and termination. During the initiation phase and in amino acids deficit condition, one of the factors involved in translation, elF2, is phosphorylated by Gcn2 causing widespread repression of translation. So, although the overall protein synthesis is diminished under these conditions, the expression of specific transcriptional activators responsible for maintaining the homeostasis is increased, by activating amino acid biosynthetic pathways. This is known general control of amino acids, where the shortage of one stimulates increased synthesis of the 20 amino acids. The presence of insufficient levels of amino acids in the cell, increase uncharged transfer RNA concentration joined Gcn2 and causing activation kinase activity. IMPACT is a highly conserved protein involved in eukaryotes in the initiation of translation avoiding Gcn2 activation by competition, kidnapping Gcn1, its cellular ligand. Yih1 is the IMPACT ortholog in yeast. Yih1 has two domains, RWD N-terminal and C-terminal domain, called ancient and highly conserved domain at all levels of living beings in which it operates. The high conservation suggests that this domain plays a major role at the cellular level. Although Gcn2 and Yih1 do not seem to share high homology of the entire sequence, important regions in the interaction between Gcn2 and Gcn1 are similar to those of Yih1. This is the Yih1 N-terminal RWD domain, which is responsible for modulating the activity of Gcn2, in overexpression situations. Normally Yih1 is in a complex with globular actin. Knowledge of the complete structure and characterization of Yih1 would provide lot of information for a better understanding of the situation. This work aims overexpression and purification using gel permeation chromatography of different constructions Yih1 and CIH, for later use in numerous assays. Small crystals were also obtained and despite they were not suitable for X-ray diffraction, they reported about favorable conditions. Some functional aspects of CIH were also characterized in their ability to DNA degradation.