Estudio de la relación entre rutas de homeostásis de iones y resistencia a antifúngicos

Abstract

[ES] Las infecciones micóticas siguen siendo un problema de salud pública en la actualidad, más importante aún para pacientes inmunosuprimidos. Entre las posibles infecciones causadas por hongos a las que son susceptibles destaca la infección por el hongo oportunista Candida albicans, la cual puede derivar en una infección sistémica con altos ratios de mortalidad. Debido al aumento de resistencias y a los efectos secundarios que causan los actuales tratamientos antifúngicos a pesar de ir dirigidos contra estructuras propias de hongos no compartidas en humanos, hay una necesidad de buscar nuevas estrategias y dianas terapéuticas para aumentar este arsenal. Con el objetivo de encontrar nuevos tratamientos enfocados en comprometer la resistencia a antibióticos que presentan las cepas resistentes, vamos a estudiar los efectos que podría tener la supresión de la actividad de ciertas rutas de transducción de señales en la resistencia a antifúngicos. Para ello, vamos a utilizar como organismo modelo al hongo Saccharomyces cerevisiae, ya que posee rutas homólogas a Candida albicans. La homeostasis de iones es un proceso esencial para la viabilidad celular, la cual está regulada por una serie de proteínas de canal y transportadoras, las cuales además en muchos casos son específicos de hongos. Se sabe que ciertos mutantes para estas proteínas presentan una menor virulencia y son sensibles a tratamientos antifúngicos muy contrastados y ampliamente usados como son los azoles. Entre estos sistemas está la ruta Rim101, la cual se encarga de la regulación de la respuesta al pH alcalino. Sin embargo, no está claro cuál es el mecanismo por el cual esta ruta está involucrada en la respuesta a antifúngicos. Aprovechando la amplia experiencia del laboratorio podemos plantear una hipótesis basándonos en un estudio anterior en el cual la proteína transportadora de iones Ena1 no se acumula apropiadamente en la membrana plasmática en cepas mutantes para componentes de la ruta Rim101. Por lo cual, podemos suponer que este fenómeno puede ocurrir en otras proteínas de membrana, y que ciertas familias de proteínas relacionadas con la resistencia a antifúngicos puedan verse afectadas. Estas proteínas se encuentran englobadas en la familia ABC (ATP binding carrier proteins) dentro de la cual encontramos a las subfamilias PDR (pleiotropic drug resistance proteins) y MDR (multidrug resistance associated proteins). De toda esta familia, la proteína Pdr5 está descrita en la literatura como el mejor candidato a conferir resistencia a antifúngicos. Para encontrar buenos candidatos para el estudio vamos a realizar un análisis más exhaustivo de la tolerancia de mutantes que carecen de los genes que codifican para miembros de las familias PDR y MDR a los antifúngicos de la familia de los azoles, fluconazol y ketoconazol. Una vez obtenidos estos resultados, se procederá a realizar una serie de experimentos para averiguar si los miembros más importantes de estas familias presentan problemas de acumulación de la proteína en la membrana plasmática en mutantes de la ruta Rim101, lo cual sería un posible mecanismo que explicase el por qué estos mutantes son sensibles a azoles. Mediante la adición por recombinación homóloga de la proteína GFP a estos candidatos se estudiará esta acumulación utilizando tecnologías como la microscopía de fluorescencia o el ensayo Western Blot. Un resultado positivo podría significar la identificación de una nueva diana terapéutica que se podría estudiar para desarrollar fármacos específicos que actúen inhibiendo esta ruta, disminuyendo así la resistencia a antibióticos y comprometiendo la supervivencia de las cepas resistentes.

[EN] Fungal infections represent an important public health problem today, especially for immunosuppressed patients. Among opportunistic fungi that provoke infections, Candida albicans is the most prevalent and may develop into a systemic infection with high mortality rates. With the aim of finding new treatments focused on compromising acquired antibiotic resistance, we plan study the effects of the suppression of the activity of some signalling pathways related with antifungal compound responses. In order to carry out this study, we will employ the model organism Saccharomyces cerevisiae, due to its homology with Candida albicans and its advantages as an experimental system. Ion homeostasis is an essential process for cell survival. It is regulated by a number of channels and transport proteins, many of which are mainly fungal specific. It is known that strains lacking certain genes important for ion homeostasis show reduced virulence and present sensitivity to well-known antifungal treatments, like azoles. Among these pathways, the Rim pathway, which responds to alkaline pH, has been reported to be involved in resistance to the azole, fluconazole. However, the mechanism by which the Rim pathway influences anti-fungal drug sensitivity is unclear. We have established a working hypothesis regarding this point based on our previous data indicating that the ion transporter protein Ena1 does not properly accumulate in the plasma membrane in Rim mutant strains. Therefore, we will test whether this phenomenon may occur for other membrane proteins, like those related to antifungal compound resistance. These proteins belong to the ABC family (ATP-Binding Cassette), within which there are two subfamilies: PDR (Pleiotropic Drug Resistance proteins) and MRP (Multidrug Resistance-Associated proteins). Therefore, we carried out growth assays in order to determine which proteins have the most important role in detoxifying azoles. Resistance profiles of a series of mutant strains lacking the genes encoding selected ABC family members were examined in both solid and liquid culture media in the presence of ketoconazole and fluconazole. This analysis revealed that PDR5 had a major role in azole resistance, because this mutation presents marked sensitivity to azoles. Thus, this gene was selected for further studies in Rim mutant strains rim8 and rim101 to determine whether Pdr5 accumulation and/plasma membrane targeting could account for the azole sensitivity of these mutants. In order to accomplish this goal, we constructed a fusion protein between Pdr5 and the Green Fluorescent Protein (GFP), using homologous recombination in the yeast genome. The success of the transformation was confirmed by growing in selective medium and by fluorescence microscopy. It was found that Pdr5 protein accumulation is not altered in the presence of azoles in the media, however we did observe an induction after citrinine treatment. We also observed that the Prd5-GFP fusion protein was able to properly accumulate at the cell membrane by confocal microscopy in the WT and the Rim pathway mutant strains. However, in the immunoblot assay, we found that the Pdr5-GFP protein displays marked degradation in rim8 and rim101 strains, with the rim101 phenotype being more severe. This degradation of Pdr5 could provide a molecular mechanism to explain the azole sensitivity of these strains and establishing a new therapeutic target, in order to develop new anti-fungal therapies. More specifically, compounds that target the fungal specific Rim pathway should reduce virulence and be effective as combined therapies with widely used azole drugs, rendering yeast cells more susceptible to these treatments.

[CA] Les infeccions micòtiques segueixen sent un problema de salut pública en l'actualitat, encara més important per als pacients immunosuprimits. Entre les possibles infeccions causades per fongs a què són susceptibles destaca la infecció pel fong oportunista Candida albicans, la qual pot derivar en una infecció sistèmica amb grans ràtios de mortalitat. Amb l'objectiu de trobar nous tractaments enfocats a comprometre la resistència a antibiòtics que presenten les soques resistents, estudiarem els efectes que podria tenir la supressió de l'activitat de certes rutes de transducció de senyals a la resistència a antifúngics. Per a això, farem servir com a organisme model el fong Saccharomyces cerevisiae, ja que té rutes homòlogues a Candida albicans. L'homeòstasi d'ions és un procés essencial per a la viabilitat cel·lular, la qual està regulada per una sèrie de proteïnes de canal i transportadores, les quals, a més en molts casos, són específics de fongs. Es sap que certs mutants per aquestes proteïnes presenten una menor virulència i són sensibles a tractaments antifúngics molt contrastats i àmpliament usats com són els azoles. Entre aquests sistemes hi ha la ruta Rim101, que s'encarrega de la regulació de la resposta al pH alcalí. No obstant això, no està clar quin és el mecanisme pel qual aquesta ruta està involucrada en la resposta a antifúngics. Aprofitant l'àmplia experiència del laboratori podem plantejar una hipòtesi basant-nos en un estudi anterior en el qual la proteïna transportadora d'ions Ena1 no s'acumula apropiadament a la membrana plasmàtica en soques mutants per a components de la ruta Rim101. Per la qual cosa, podem suposar que aquest fenomen pot ocórrer en altres proteïnes de membrana, i que certes famílies de proteïnes relacionades amb la resistència a antifúngics es puguin veure afectades. Aquestes proteïnes es troben classificades en la família ABC (ATP Binding Carrier proteins) dins de la qual trobem a les subfamílies PDR (Pleiotropic Drug Resistance proteins) i MDR (Multidrug Resistance-Associated proteins). Així doncs, es van realitzar els experiments pertinents per tal de comprovar quina proteïna presentava un major paper en la detoxificació de la cèl·lula en presència de azoles, en concret ketoconazol i fluconazol. Es van examinar els perfils de resistència de soques mutants per a una sèrie de gens pertanyents a aquestes famílies mitjançant cultius en medis tant líquid com sòlid i en presència d'aquests compostos, obtenint com a resultat que PDR5 era la més important; a causa que la seva mutació, presentava en les cèl·lules una enorme sensibilitat als azoles. Així doncs, es va seleccionar aquest gen per a ser estudiat en soques que foren mutants per als gens RIM8 i RIM101, i comprovar si arribava de manera adequada a la membrana i en quines condicions ho feia. Per a realitzar aquest estudi, es va procedir a construir una proteïna de fusió amb Pdr5 i Gfp, utilitzant per a això la tècnica de la recombinació homòloga entre el genoma de llevat i un inserit format per GFP i HIS3 amplificat d'un plasmidi amb encebadors que incloïen part de la seqüència de PDR5. Aquesta transformació va reeixir i es va poder comprovar tant per creixement en medi sense histidina com per fluorescència. El gen va demostrar que amb prou feines variava la seva expressió després del tractament amb azoles, romanent la seva expressió constant, encara que sí que va resultar induïble per la micotoxina citrinina. Per microscòpia confocal es va detectar que laproteïna de fusió arribava a la membrana perfectament i que gairebé no hi havia en el citoplasma. No obstant això, per assaig Western Blot vam poder comprovar que la proteïna de fusió es troba molt degradada en les soques transformades que tenen suprimits els gens RIM8 i RIM101, a causa que es detectaven bandes borroses per sota de pes corresponent, la qual cosa indica una disrupció de la proteïna, fet que podria explicar la seva manca de funció i establir així una possible diana terapèutica per desenvolupar un nou tractament.