Desenvolupament d’un vector d’expressió en plantes derivat del virus del mosaic de la tomaca

Abstract

[CA] El virus del mosaic de la tomaca (ToMV; gènere Tobamovirus, família Virgaviridae) consisteix en un ARN genòmic d’aproximadament 6400 nucleòtids que s’encapsida en virions en forma de vareta formats per subunitats de la proteïna de coberta (CP). Les partícules d’aquest virus són molt estables i es transmeten molt eficientment a plantes de tomaca i altres espècies hortícoles d’interès agronòmic provocant importants pèrdues en els cultius. Existeixen gens de resistència contra aquest virus, però en la natura apareixen contínuament variants de seqüència virals amb la capacitat de superar-la. Els tobamovirus es caracteritzen per envair els seus hostes amb gran rapidesa i produir enormes quantitats de les seues CP en els teixits infectats. Aquestes propietats converteixen el ToMV en un virus molt interessant com a punt de partida per generar un vector d’expressió de proteïnes en tomaca, aprofitant així la seua capacitat de moviment en l’hoste i la potència del promotor subgenòmic que produeix l’ARN missatger de la seua CP. L’objectiu d’aquest projecte va ser construir un vector d’expressió derivat d’un clon infecciós del ToMV i emprar-lo per produir carotenoides, una classe de productes naturals d’interès farmacèutic, nutricional i industrial, en plantes. Els carotenoides, a més, com que són compostos acolorits actuen com a reporters que permeten el seguiment visual de la infecció viral. Primer es va construir un clon recombinant viral en el que un ADN còpia que codificava la fitoé sintasa (crtB) de la bactèria Pantoea ananatis va substituir la major part de la CP del ToMV. En aquest clon viral la crtB s’expressava a partir del promotor de la CP del virus. Els teixits de Nicotiana benthamiana infectats per aquests virus mostraren una forta coloració groga als pocs dies postinoculació. Tanmateix, la pigmentació groga no es va estendre més enllà del teixit infiltrat, ja que al mancar-li la CP el virus era incapaç d’envair la planta a nivell sistèmic. A continuació, partint d’aquest clon viral, es va inserir el gen de la CP (incloent els seu promotor) i la major part de la regió 3’ no traduïda d’un altre tobamovirus, el virus del mosaic del tabac, per darrere de la crtB. La inoculació de plantes de N. benthamiana amb aquest segon clon viral recombinant va provocar una forta pigmentació groga al teixit inoculat però també en fulles superiors no inoculades, indicant que aquest virus sí era capaç de moure’s sistèmicament. En conclusió, en aquest treball s’ha construït un clon viral derivat del ToMV que, per una banda, permet seguir visualment la infecció viral, fet que ajudarà a investigar la biologia del virus i a cercar nous gens de resistència i, per altra banda, és una ferramenta biotecnològica que permet produir grans quantitats de carotenoides en teixits vegetals.

[ES] El virus del mosaico del tomate (ToMV; género Tobamovirus, familia Virgviridae) consiste en un RNA genómico de aproximadamente 6400 nucleótidos que se encapsida en viriones en forma de varilla formados por subunidades de la proteína de cubierta (CP) viral. Las partículas de este virus son muy estables y se transmiten muy eficientemente a plantas de tomate y otras especies hortícolas de interés agronómico provocando importantes pérdidas en los cultivos. Existen genes de resistencia contra este virus, pero en la naturaleza aparecen continuamente aislados capaces de saltarse esta resistencia. Dos propiedades de los tobamovirus, para las que el ToMV no es una excepción, son que estos virus son capaces de invadir sus huéspedes con gran rapidez y que como consecuencia de la replicación viral se producen enormes cantidades de sus CP en los tejidos infectados. Estas propiedades convierten al ToMV en virus muy interesante como punto de partida para generar un vector de expresión de proteínas en tomate y así aprovechar su capacidad de movimiento en el huésped y la potencia del promotor subgenómico que produce el mRNA de su CP. En nuestro grupo de investigación, recientemente hemos clonado el genoma de un aislado español del ToMV que rompe la resistencia del gen Tm2. A partir de la secuencia clonada hemos conseguido infectar muy eficientemente plantas de tomate mediante agroinoculación. El objetivo de este proyecto es construir un vector de expresión derivado de nuestro clon infeccioso del ToMV que permita expresar proteínas en plantas de tomate de una manera eficiente. Para ello modificaremos el promotor sugenómico viral que promueve la expresión del mRNA de la CP para que permita la expresión de proteínas recombinantes. Al mismo tiempo insertaremos una serie de promotores subgenómicos heterólogos provenientes de distintos tobamovirus, buscando uno que produzca de forma eficiente la CP viral y no promueva la recombinación con el promotor nativo, lo que preservará la estabilidad de los clones recombinantes. Para analizar la eficiencia en la expresión de las proteínas recombinantes, insertaremos el cDNA de la fitoeno sintasa de la bacteria Pantoea ananatis que impulsa la ruta biosintética de carotenoides en plantas y que nos permitirá seguir visualmente la expresión de la proteína recombinante.

[EN] Tomato mosaic virus (ToMV; genus Tobamovirus, family Virgaviridae) consists of a genomic RNA of about 6400 nucleotides which is encapsidated in virions formed by the coat protein (CP). The particles of this virus are very stable and they are transmitted very efficiently to tomato plants and other horticultural species of agronomic interest, causing significant crop losses. There are resistance genes against this virus, but in nature viral sequence variants with the ability to overcome it continuously appear. Tobamoviruses are characterized by invading their guests very quickly and by producing huge amounts of their CP in infected tissues. These properties make the ToMV a very interesting virus as a starting point to generate a protein expression vector in tomato, exploiting their movement in the host and their powerful subgenomic promoter to produce the CP messenger RNA. The objective of this project was to construct an expression vector derived from an infectious clone of ToMV and to use it to produce carotenoids in plants. Carotenoids are natural products of pharmaceutical, nutritional and industrial interest. Furthemore, as carotenoids are coloured compounds, they can act as reporters that allow visual monitoring of viral infection. In brief, a copy DNA encoding phytoene synthase (crtB) of the bacterium Pantoea ananatis was used to replace most of the CP sequence of ToMV, allowing expression under the virus CP promoter control. Nicotiana benthamiana tissuesinfected with this viral construction showed strong yellow colouration within a few days after inoculation. The yellow pigmentation did not spread beyond infiltrated tissues, since the virus CP was missing and the virus was unable to invade the plant systemically. Next, the CP gene (including its promoter) and most of the 3’ untranslated region of another tobamovirus, tobacco mosaic virus, was inserted downstream the crtB sequence in the viral construct. Inoculation of N. benthamiana plants with this second recombinant viral clone caused a strong yellow pigmentation in the inoculated tissue, but also in non-agroinoculated upper leaves. This results show that the virus itself was able to move systemically. In conclusion, a viral clone derived from ToMV has been constructed that allows following visually the viral infection, which will help to study the biology of the virus and to screen for new resistance genes, and also offers a biotechnology tool to produce large amounts of carotenoids in plant tissues.