Detección y análisis de miRNAs implicados en la regulación de la respuesta a estrés en Cucumis melo

Abstract

[ES] Las plantas, como organismos sésiles que son, necesitan desarrollar respuestas rápidas y eficientes para poder sobrevivir a los diferentes estreses medioambientales a los que pueden ser sometidas. Existen numerosos estudios acerca de estas respuestas basados en los principios clásicos de la biología molecular, sin embargo, a principios de los 90 se describieron diferentes especies de pequeños RNAs (sRNAs) no codificantes que presentaban actividad reguladora. Todavía queda mucho para comprender el modo de acción de estos sRNAs. La mayoría del conocimiento obtenido hasta el momento está basado en estudios realizados en organismos modelo, como es el caso de Arabidopsis thaliana, sin embargo, poco se conoce acerca de la importancia de estos elementos reguladores en especies cultivadas.

Dado que el genoma de Cucumis melo ha sido completamente secuenciado y debido a la importancia económica de esa especie en España, en nuestro laboratorio se sometieron plantas de C. melo var. piel de sapo a diferentes condiciones potencialmente estresantes, y los sRNAs extraídos de ellas se secuenciaron de forma masiva (New Generation Sequencing). De esta forma se identificaron muchas especies diferentes de sRNAs, sin embargo centramos nuestro estudio en una de ellas, los miRNAS, por ser su biosíntesis, estructura y modo de acción bien conocidas.

En este ensayo se describe un método para la detección y amplificación específica de miRNAs maduros de C. melo, algunos de los cuales pueden estar implicados en la regulación de las respuestas a estrés. Además, se analizó la acumulación relativa de éstos en diferentes condiciones de estrés por RT-PCR cuantitativa, y los resultados obtenidos se emplearon para validar los datos obtenidos de la secuenciación masiva. Adicionalmente, se estudió la abundancia relativa de las posibles dianas de mRNA de estos miRNAs con el fin de poder establecer una correlación entre ellos e intentar inferir el modo de acción.

[EN] Plants, as sessile organisms, need to develop rapid and efficient responses in order to survive to environmental stresses. Many studies were performed regarding this issue based on the classical principles of molecular biology, however in the early 90's new non-coding short RNAs (sRNAs) were identified having regulatory activities, and their mode of action is now starting to be deciphered. Most of the knowledge on sRNAs in plants rely on the studies performed in Arabidopsis thaliana or related model organisms, however little is known about the importance of this regulatory elements in crops.

Taking advantage of the complete sequencing of the Cucumis melo genome and the economical importance of this crop in Spain, in our lab plants of C. melo var. piel de sapo were subjected to several stresful conditons and their sRNAs were extracted and subjected to New Generation Sequencing (NGS). Many different species of sRNAs were identified, however we centered our study in miRNAs, whose biosinthesis, structure and mode of action have been described in depth.

In this essay we describe a method to detect and amplify specific mature miRNAs of C. melo putatively involved in the regulation of stress responses. Furthermore, their relative accumulation under different stress conditions was assayed by real-time RT-PCR and the results were used to validate the data obtained by NGS. Additionally, RT-qPCR was also employed to elucidate the effect of these miRNAs in the relative abundance of their mRNA targets in order to better understand their mode of action.