Desarrollo de un método rápido de detección de expansiones en C9orf72 relacionadas con la ELA

Abstract

[ES] Las expansiones del hexanucleótido GGGCC en el intrón 1 del gen C9ORF72 han sido descritas como causantes de Esclerosis Lateral Amniotrófica con Demencia Fronto-Temporal (ELA/DFT) (DeJesus-Hernandez et al, 2011). El método de detección usado combina repeat-primed PCR y análisis de fragmentos con Southern-Blot. La PCR y análisis de fragmentos tiene el problema de ser una técnica excesivamente cara, mientras que el Southern-Blot es excesivamente lento (protocolo de 1 semana). También se han observado estas expansiones, así como las inclusiones neuronales de las proteínas que se generan, en otras enfermedades neurológicas como Alzheimer o Huntington (Beck et al, 2013), o esquizofrenia (Galimberti et al, 2014). Posteriormente se han desarrollado métodos basados en inmuno dot-bots en líquido céfalo-raquídeo (Zu et al, 2013), que tienen el inconveniente de la dificultad de la toma de muestras, además de ser dolorosa para el paciente. En el presente proyecto se pretende desarrollar un método de dot-blot sobre ADN genómico total obtenido a partir de sangre periférica o saliva del paciente. Para ello se dispone de una sonda de ADN clonada para su marcaje con digoxigenina, que presenta la ventaja de tener mayor número de repeticiones que las usadas convencionalmente (25 repeticiones del hexanucleótido de nuestra sonda frente a 5 de las sondas convencionales). Además se dispone de un dispositivo de dot-blot que permite analizar 96 muestras de ADN cada vez. Utilizando estas dos herramientas, se pretende analizar una colección aproximadamente 3000 muestras, con el objetivo de conocer la prevalencia de estas expansiones en otras enfermedades neurológicas.

[EN] Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is the most common type of muscular neurodegenerative disease with fatal prognosis and for which there is no cure available yet. It is a complex heterogeneous disease whose etiology remains unknown. Moreover, the genetic component only contributes to 5-10% of the cases while the remaining 90-95% of the cases are classified as sporadic. Several loci have been associated with the disease, among which C9orf72 has been recently identified; it is a gene in which a non-coding GGGGCC hexanucleotide repeat expansion has been assumed to be the responsible for almost half of the genetic ALS cases. Moreover, expansions in such gene have also been associated, albeit less frequency, to other neurological diseases both motor and non-motor ones. C9orf72 expansion detection methods used in diagnosis combine repeat-primed PCR and fragment analysis along with Southern blot but have the limitation of being too costly and/or time consuming. The present projects aims to develop a fast detection method for such expansions based on dot blot techniques using specific DNA probes. Once such methodology has been developed, it could be applied for mass analysis in order to establish the prevalence of these expansions in other neurological diseases. It could also be used as a filtering method prior to performing the Southern blot technique.