Impacto de la tecnología de secuenciación masiva en el cáncer de pulmón no microcítico

Abstract

[ES] Introducción En el cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) es necesaria la identificación de biomarcadores que permitan la caracterización molecular del tumor y, con ello, adecuar el manejo de los pacientes1. En este sentido, el receptor de crecimiento epidérmico (EGFR) y la kinasa del linfoma anaplásico (ALK) desempeñan un papel relevante como marcadores predictivos de respuesta a la terapia oncológica, en concreto a los inhibidores tirosina quinasa (TKIs). Se han descrito diferentes aproximaciones para su determinación (mutaciones de EGFR y translocaciones de ALK) siendo la real time-PCR (qPCR) y la FISH2,3, respectivamente, las técnicas más ampliamente utilizadas. Con el desarrollo de las tecnologías de nueva generación, como la secuenciación masiva (Next Generation Sequencing; NGS), se abre la posibilidad de analizar simultáneamente diferentes alteraciones oncogénicas driver implicadas en la patogénesis del CPNM. Asimismo, esta nueva tecnología permite minimizar algunas complicaciones habituales de la rutina asistencial, como son los altos requerimientos de muestra, la disposición de múltiples tecnologías para abordar los distintos marcadores y un importante consumo de tiempo para proporcionar los resultados al clínico.

Hipótesis y Objetivos La NGS puede ayudar a clasificar el tumor al diagnóstico y guiar a los pacientes con CPNM avanzado en el tratamiento con terapias dianas. Por ello, el objetivo del siguiente trabajo de fin de grado (TFG) será una breve contextualización de la medicina personalizada en el CPNM y la comparación de los métodos empleados actualmente en el laboratorio de diagnóstico frente a nuevas tecnologías desarrolladas, como la NGS.

Material y métodos Sujetos de estudio: Estudio prospectivo efectuado sobre muestras de tejido tumoral (FFPE) de pacientes con CPNM avanzado atendidos en el Servicio de Oncología Médica del Hospital Universitario y Politécnico La Fe. Durante el desarrollo del proyecto, se estima el estudio de aproximadamente 30 pacientes. Todos ellos deberán haber manifestado por escrito su consentimiento informado. Instrumentalización y determinaciones: Extracción de ácidos nucleicos (DNA y RNA) a partir de material tumoral incluido en parafina (FFPE). Este protocolo de trabajo incluye el desparafinado de la muestra y la obtención y purificación de los ácidos nucleicos. Para ello se utilizarán los kits GeneReader DNA FFPE Kit4 (QUIAGEN) para DNA y RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit for FFPE5 (ThermoFisher) para RNA. Determinación de mutaciones en el gen EGFR mediante cobas® EGFR Mutation Test v2 (CE-IVD) de Roche Molecular en la plataforma Cobas® 480z Analyzer6, que permite la detección de mutaciones puntuales, deleciones y/o inserciones en los exones 18, 19, 20 y 217. Los casos positivos serán confirmados por secuenciación capilar (Applied Biosystems® 3130 Genetic Analyzer) utilizando los protocolos recomendados por el fabricante. Secuenciación masiva mediante la tecnología del IonTorrent (secuenciación por semiconductores) en la plataforma Personal Genome Machine (PGM ; Applied Biosystem)8. Inicialmente, se requiere la preparación de las librerías, empleándose para ello los paneles Ampliseq Oncomine Solid Tumor DNA kit y Oncomine® Solid Tumour Fusion Transcript kit (Thermo Fisher Scientific) que permiten el análisis de 22 oncogenes (KRAS, EGFR, BRAF, PIK3CA, AKT1, ERBB2, PTEN, NRAS, STK11, MAP2K1, ALK, DDR2, CTNNB1, MET, TP53, SMAD4, FBX7, FGFR3, NOTCH1, ERBB4, FGFR1, FGFR2) y cuatro transcritos de fusión (ALK, ROS1, RET and NTRK1), respectivamente9.

Bibliografía 1- Ingelman-Sundberg, M. (2014) Personalized medicine into the next generation. Journal of Internal Medicine, 277: 152-154. doi: 10.1111/joim.12325 2- Gómeza, J. J.; Castro, J.; Concha, A; Felip, E.; Isla, D.; López-Ríos, F.; Paz-Ares, L.; Ramírez, J.; Sanzi, J.; Garrido, P. (2012) Recomendaciones para la determinaci

[EN] Introduction Identification of biomarkers that allow the molecular characterization of the tumor is necessary in non-small cell lung cancer (NSCLC) in order to provide the patient the most appropriate treatment1. In this sense, the epidermal growth factor receptor (EGFR) and the anaplastic lymphoma kinase (ALK) play an important role like predictive biomarkers in response to oncology therapy, in special to tyrosine kinase inhibitors (TKIs). Some approaches have been defined in order to determinate those biomarkers (EGFR mutations and ALK translocations), being real-time PCR (qPCR) and fluorescence in situ hybridization (FISH)2,3, respectively, the most relevant technologies used in clinic. With the development of new generation technologies like massive sequencing (Next Generation Secuencing; NGS), it is possible to identify oncogenic driver mutations implicated in the NSCLC pathogenesis. This recent technology can minimize some common complications of routine care, like high sample requirement, diverse technologies used to identify different biomarkers and the long times required to provide results to the clinic.

Hypothesis and objectives NGS could help to classify tumor in diagnosis and guide advanced NSCLC patients to appropriate targeted therapies. Thus, the objective of this Trabajo final de grado (TFG) is contextualize personalized medicine in NSCLC treatment and compare the habitual methods used in a diagnostic laboratory with new technologies like NGS.

Material and methods Study subjects A prospective study in formalin-fixed paraffin embedded (FFPE) tissue samples is proposed. Samples of patients with advanced NSCLC are from Medic Oncology Service of Hospital Universitario y Politécnico La Fe . During the development of this project, it is estimated to study at least 30 patients who must sign the informed consent.

Instruments and methods Nucleic acids isolation (DNA and RNA) from FFPE tissue samples. The process includes a previous step of paraffin removal, and isolation and purification of the nucleic acids. DNA will be obtained using GeneReader DNA FFPE Kit4 (QUIAGEN) and RNA with RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit for FFPE5 (ThermoFisher). Detection of mutations in EGFR gene with cobas® EGFR Mutation Test v2 (CE-IVD) of Roche Molecular in the platform Cobas® 480z Analyzer6. This kit is able to detect point mutations and indels in exons 18, 19, 20 and 217. Positive samples will be confirmed by capillary sequencing (Applied Biosystems® 3130 Genetic Analyzer) according to fabricant protocols. Massive sequencing using IonTorrent technology (sequencing by semiconductors) in the platform Personal Genome Machine (PGM ; Applied Biosystem)8. Previously, libraries are prepared employing Ampliseq Oncomine Solid Tumor DNA kit and Oncomine® Solid Tumour Fusion Transcript kit (Thermo Fisher Scientific). The first panel is capable to identify 22 oncogenes and tumor suppressor genes (KRAS, EGFR, BRAF, PIK3CA, AKT1, ERBB2, PTEN, NRAS, STK11, MAP2K1, ALK, DDR2, CTNNB1, MET, TP53, SMAD4, FBX7, FGFR3, NOTCH1, ERBB4, FGFR1, FGFR2), and the second detect the expression of four fusion transcrits (ALK, ROS1, RET and NTRK1)9.

References 1- Ingelman-Sundberg, M. (2014) Personalized medicine into the next generation. Journal of Internal Medicine, 277: 152-154. doi: 10.1111/joim.12325 2- Gómeza, J. J.; Castro, J.; Concha, A; Felip, E.; Isla, D.; López-Ríos, F.; Paz-Ares, L.; Ramírez, J.; Sanzi, J.; Garrido, P. (2012) Recomendaciones para la determinación de biomarcadores en el carcinoma de pulmón no microcítico avanzado. Consenso nacional de la Sociedad Española de Anatomía Patológica y de la Sociedad Española de Oncología Médica. Rev Esp Patol, 45: 14-28 3- Garcia-Foncillas, J; Garrido, P; Gómez, J; Palacios, J; Tarón, M. (2011) Recomendaciones para la determinación de las mutaciones del gen EGFR en el carcinoma de pulmón no microcítico. RevEsp Patol, 44, 17-31