Alteraciones en la percepción del ácido salicílico por mutagénesis en levadura

Abstract

En nuestro laboratorio trabajamos en la percepción del ácido salicílico (SA) por la planta Arabidopsis thaliana. El SA es la primera molécula a la que se atribuyó un papel importante en la intermediación de la transducción de la señal patogénica. El incremento en los niveles endógenos de SA y de sus conjugados en plantas infectadas coincide con la activación de genes que codifican para proteínas PR (Relacionadas con Patogénesis) y con el establecimiento de la resistencia en la planta. De este modo, las plantas que no perciben SA son más susceptibles a algunos patógenos, mientras que la aplicación del SA aumenta la resistencia de las plantas.

La cascada de señalización mediada por SA está constituida por un conjunto de proteínas que juegan un papel importante en el establecimiento y prolongación de la respuesta de defensa (SAR; Resistencia Sistémica Adquirida). Entre ellas se han identificado NPR1 (No expresor de genes PR) y βCAs (Anhidrasa Carbónica). NPR1 codifica para un regulador positivo de SAR, actuando corriente abajo del SA. La función de este gen es conservada en numerosas especies de plantas y los mutantes deficientes son sensibles al ataque por patógenos. Las CAs son metaloenzimas que catalizan la conversión rápida de dióxido de carbono y agua a bicarbonato y protones. El centro activo de la mayoría de las CAs contiene un ión de zinc. En plantas se han identificado CAs de tipo α, β y γ que participan en la fijación de carbono del CO2 en diferentes partes de la célula. Concretamente, ciertas βCAs han sido descritas como proteínas de unión al SA (SABP) y su papel en la fotosíntesis está cuestionado.

Trabajos previos en nuestro laboratorio mediante un rastreo en el sistema de doble híbrido de levadura (Y2H), han permitido identificar que las proteínas NPR1 y CA1 interaccionan sólo en presencia de SA. El trabajo a desarrollar por el alumno como Trabajo de Fin de Máster consiste en el estudio de dicha interacción (aumentándola o disminuyéndola) por diferentes aproximaciones. La ventaja de utilizar levadura es que es fácil seleccionar aumentos o disminuciones de la interacción alterando la composición del medio.

Esta aproximación consiste en llevar a cabo mutagénesis de NPR1 y CA1 por PCR mediante el sistema RCA (Rolling Circle Amplification) que emplea la ADN polimerasa del fago Φ29. Una vez mutagenizadas estas proteínas, el alumno procederá a rastrear aquellas mutaciones que sean de mayor interés, buscando, preferentemente, mutaciones que generen (1) interacción independiente de SA, (2) mayor afinidad por el SA, y (3) no interacción.

A continuación, una vez identificadas las proteínas mutagenizadas de interés, se procederá a testar su (1) capacidad de unión a SA y (2) su actividad CA en el caso de CA1. En el caso de las mutaciones de NPR1, (1) se testarán las interacciones con otras CAs que normalmente interaccionan con NPR1.

En función de la consecución de los objetivos anteriores, cabe la posibilidad de abordar nuevos propósitos tales como (1) la construcción de una genoteca de ADN copia de Arabidopsis en pARC352 para la generación de un triple híbrido de levadura que contenga NPR1+CA1 junto con un tercer miembro que interfiera en la interacción, bien de forma positiva o negativa y (2) llevar a cabo un rastreo en levadura mediante genética química con el propósito de identificar nuevos compuestos químicos que interfieran en la interacción NPR1+CA1 de forma antagonista y también agonista.