Caracterización de un antiveneno experimental generado en conejo contra el veneno del colúbrido Boiga irregularis y estudio de su reactividad cruzada frente a venenos de elápidos

Abstract

[ES] El envenenamiento por mordedura de serpiente es una patología desatendida y una causa importante de morbilidad y mortalidad que afecta particularmente a comunidades rurales y económicamente deprimidas en regiones tropicales de África sub-Sahariana, Asia, América Latina y Oceanía. La única terapia efectiva conocida es la utilización de antivenenos generados por hiperinmunización de grandes mamíferos (generalmente caballo, aunque también oveja, camello o dromedario). Una manera de optimizar la utilización de un antiveneno es el estudio de su inmunoreactividad homóloga (frente a la mezcla de venenos utilizados en su producción) y heteróloga (frente a venenos no utilizados en su generación). El veneno de las serpientes es una de las armas bioquímicas más poderosas del reino animal y varía tanto espacia como temporalmente inter- o intra-especie. Aproximadamente, existen unas 3500 especies de serpientes que se agrupan en 26 familias y unos 400 géneros, de las cuales 600 son venenosas. Las serpientes venenosas se clasifican en 3 grandes familias: Elapidae (mambas, cobras, serpiente de coral), Viperidae (víboras, serpientes de cascabel) y Colubridae (serpientes comunes). La mayor parte de los colúbridos son completamente inofensivos porque su saliva no es lo bastante tóxica como para constituir un peligro para el ser humano y porque a pesar de tener glándula de Duvernoy activa en la producción de toxinas, carecen de un eficiente aparato para inocular el veneno. Boiga irregularis es una serpiente de la familia Colubridae pero la secreción de su glándula de Duvernoy es rica en proteínas de la familia 3FTx ("three finger toxins”), típicas de la familia Elapidae. No obstante, estas proteínas, que en elápidos son potentes neurotoxinas, no presentan toxicidad en mamíferos, sino que son tóxicas específicamente para aves, sus presas habituales. Con esta premisa, el objetivo en este proyecto es el estudio de un antiveneno experimental generado en conejos frente al veneno de B. irregularis. Utilizando el método denominado "antivenómica de segunda generación", se caracterizó el perfil de reconocimiento del antiveneno frente a veneno homólogo y frente a veneno de un individuo neonato de la misma especie, y se analizó su reactividad cruzada frente a venenos de serpientes de la familia Elapidae. Para ello se generaron columnas de inmunoafinidad, inmovilizando las IgGs del antiveneno en una matriz de Sepharose 4B activada con CNBr. Posteriormente se incubaron los diferentes venenos a analizar con la matriz y se recogieron las fracciones no retenidas (componentes del veneno frente a los que el antiveneno no presenta afinidad) y retenida de la columna de inmunoafinidad. Ambas fracciones se analizaron mediante cromatografía de alta eficiencia utilizando una columna C18 de fase reversa (RPHPLC). La comparación cualitativa y cuantitativa de los perfiles cromatográficos del veneno completo y de las fracciones de la columna de inmunoafinidad nos permitió determinar el grado de inmunoreactividad homóloga y paraespecifica del antiveneno. Los resultados obtenidos demuestran que el individuo neonato y adulto de B. irregularis tienen el mismo perfil inmunogénico. Además se comprobó que el antiveneno no reconoce las three finger toxins de elápidos por lo que se puede decir que existe variabilidad dentro de una misma familia de proteínas.

[EN] Snakebite poisoning is an unattended pathology and an important morbidity and mortality cause that affects specially to rural and economically poor communities of tropical regions of Sub-Saharan Africa, Asia, Latin America and Oceania. The utilization of antivenoms that have been generated by hiperimmunization of large mammals (generally horses and sometimes sheep, camel or dromedary) is the unique effective therapy that it is known. A way in order to optimize the utilization of an antivenom is by studying its homologous (versus the pool of venoms that are used in its production) and heterologous inmunoreactivity (versus venoms not used during its generation). Snake venom is one of the most powerful biochemical weapons in the animal’s world, and it varies spatially and temporally between species or between individuals of the same specie. There are known among 3500 snake species that are classified in 26 families and 400 genres, approximately. From those, 600 are venomous. When referring to venomous snakes, there exist 3 main families: Elapidae (mamba, cobra, coral snake), Viperidae (vipers, rattle snakes) and Colubridae (common snakes). Most colubrids are harmful due to its saliva which is not toxic enough in order to be dangerous for humans. Moreover, they are ophistogliphas, so they do not have the machinery to inoculate the venom efficiently, despite of having Duvernoy gland. Boiga irregularis is a snake of Colubridae family but its Duvernoy gland’s secretion is rich in proteins of the 3FTx ("three finger toxins") family, that are common in Elapidae family. This proteins, in elapids, are potent neurotoxins, but in colubrids they do not show toxicity for mammals; they are specifically toxic for birds, that are their natural preys. By knowing this, the aim of this project is to study the experimental antivenom that was generated in rabbits by using B. irrregularis venom. With the “second generation antivenomics” methodology, the recognition profile of the antivenom versus the homologous venom and the venom from a newborn of the same specie were characterized, and the cross reactivity of this antivenom versus Elapidae snakes was analyzed. To do that, immunoaffinity columns were generated by immobilizing the antivenom IgGs in a Sepharose 4B matrix activated with CNBr. Lately, the venoms that were going to be analyzed were incubated with the chromatography matrix and the non retained (venom compounds that the antivenom does not shown affinity for) and retained and eluted fractions of the immunoaffinity column, were collected. Both fractions were analyzed by high efficiency chromatography by using a C18 reverse phase column (RPHPLC). Quantitative and qualitative comparation of the chromatographic profiles of the complete venom and the fractions of the immunoaffinity column, were needed in order to determine the homologous and paraspecific antivenom immunoreactivity degree. The results obtained showed that newborn and adult individuals of B. irregularis have the same immunogenic profile. Moreover, the antivenom could not recognize the proteins of the elapid venom, reflecting the variability that exists between the same family of proteins.