Production, purification and characterization of the extracellular domain of p75

Abstract

[EN] The objective of this TFG is to develop a protocol for the purification of the extracellular domain of the neurotrophin receptor p75, as well as to purify this same receptor and depending on the results, characterize its function and structure. To that end, two different constructs of the receptor will be transfected into HEK 293 cells: -One construct with the extracellular domain of p75 linked to a histidine tail and to an HA tag. -One construct with the same domain, with a mutation in the 228th residue, so a threonine is converted to a cisteine residue so that constitutive dimerization happens. It also has a histidine tail and a HA tag. The purification will be performed mainly by the use of an affinity column for histidine tails, as well as other complementary methods such as dialysis. The aim is to obtain the highest possible quantity of purified protein for further assays. After production and purification of both constructs, if results are favorable, several tests and assays will be carried out in order to characterize the structure and interaction of the receptor with its ligand, neurotrophin NGF.

[ES] El objetivo del TFG es el de desarrollar un protocolo de purificación del dominio extracelular del receptor de neurotrofinas p75, así como purificar este mismo receptor y en función de los resultados, caracterizar su función y estructura. Para ello se realizará la trasfección de dos construcciones distintas de dicho receptor en células HEK 293: -Una construcción con el dominio extracelular de p75, junto a una cola de histidinas y una región HA, que abarca un total de 244 aminoácidos. -Una construcción con el mismo dominio, con una mutación en el aminoácido 228, que pasa de ser una treonina a presentar una cisteína, lo que permite la dimerización constitutiva del receptor. También presenta cola de histidinas y región HA. La purificación se realizará principalmente mediante columnas de afinidad para las colas de histidina, así como con otros métodos complementarios como la diálisis. Se trata de obtener la mayor cantidad de proteína pura posible, para realizar a continuación diversos ensayos. Tras la producción y purificación de ambas construcciones, si los resultados son favorables, se realizarán también diversas pruebas y ensayos para caracterizar la estructura e interacciones del receptor al unirse su ligando, la neurotrofina NGF.