Studies of the Protein-protein interaction between the AtKAT1 potassium channel and its putative regulators

Abstract

[EN] Potassium is one of the most important cationic nutrients for all living organisms. Among its various roles, it takes part in plant stomatal aperture as it influences osmotic potential of the cells surrounding the stomata (guard cells). This direct link between [K+ ] and plant transpiration rate, and therefore plant water loss, makes K+ transport extremely interesting, especially for the development of drought resistant plants. The KAT1 inward rectifying potassium channel has been proposed to be the major pathway for potassium influx in guard cells. This channel belongs to the Shaker family, which are selective voltage gated channels conserved throughout all Kingdoms. They are essential for stomatal responses to fluctuating environment or internal signalling. Therefore, understanding KAT1 regulation has become one of the main goals of research in the field. Screening of a cDNA library of Arabidopsis thaliana genes with the Split-Ubiquitin proteinprotein interaction assay produced 18 proteins as putative KAT1 interactors. Fourteen of these possible candidates were further confirmed in terms of their specificity for KAT1. For this reason, the purpose of this project is to employ the GoldenBraid cloning system, a standardized assembly system based on type IIS restriction enzymes, to study the interaction between the KAT1 potassium channel and one of the candidate proteins in plants. This system allows multigenic assemblies of reusable modules, which are not only useful in this study, but also for the testing of the other candidate interactors. Using the GoldenBraid technology, a series of constructs will be generated in order to carry out Bimolecular Fluorescence Complementation assay (BiFC) in planta (by means of Agrobacterium-mediated transient transformation of Nicotinana benthamiana). In the BiFC assay, the yellow fluorescent protein (YFP) is divided into 2 non-fluorescent segments and fused to the interacting proteins. Upon protein-protein interaction, both fragments of YFP are able to associate, re-fold and generate fluorescence which can be visualized using fluorescence microscopy.

[ES] El potasio es uno de los nutrientes catiónicos más importantes para todos los organismos vivos. Entre sus muchas funciones participa en la apertura de estomas de las plantas ya que tiene influencia sobre el potencial osmótico de las células que se encuentran alrededor de los estomas (las células guarda). Un vínculo tan directo entre la [K+ ] y la transpiración en plantas, y por consecuencia con la pérdida de agua, convierte el transporte de potasio en un punto de especial interés en el desarrollo de especies más resistentes a la sequía. El canal rectificador de entrada de potasio KAT1 se ha propuesto como la mayor ruta de flujo de potasio hacia el interior de las células guarda. Este canal forma parte de la familia de canales Shaker, una familia de canales selectivos dependientes de voltaje que están conservados en todos los reinos. Son esenciales para las respuestas de los estomas al ambiente variable o a los diferentes estímulos internos. Por ello, la comprensión de la regulación de KAT1 se ha convertido en un objetivo prioritario para la investigación en este campo. El rastreo de una biblioteca de cDNA de genes de Arabidopsis thaliana por el sistema de estudio de interacción proteína - proteína Split-Ubiquitina devolvió 18 proteínas putativas de interactuar con KAT1. De catorce de ellos se reafirmó la especificidad de la interacción con la proteína KAT1. Por ello, el objetivo de este proyecto es el empleo del sistema de clonaje GoldenBraid, un sistema de ensamblaje estandarizado basado en enzimas de restricción tipo IIS, al estudio de la interacción del canal de potasio KAT1 con una de las proteínas candidatas a interactuar con él. Este sistema permite ensamblajes multigénicos de módulos reutilizables, siendo de esta forma no solo útil en este estudio sino también para el estudio de las interacciones de KAT1 con otras posibles proteínas reguladoras. Empleando la tecnología GoldenBraid se producirán una serie de construcciones para llevar a cabo un ensayo bimolecular de complementación de fluorescencia (Bimolecular Fluorescence Complementation - BiFC), directamente sobre las células de la planta (mediante la transformación transitoria de Nicotiana benthamiana mediada por Agrobacterium). En los ensayos BiFC la proteína fluorescente amarilla se divide en dos segmentos no fluorescentes y se fusiona a las proteínas a estudiar. Si se da la interacción proteína-proteína los fragmentos de YFP se asocian, reconstituyendo la proteína en su estructura original y se genera fluorescencia, que puede visualizarse con un microscopio de fluorescencia.