Genotipado a tiempo real basado en SNPs para caracterizar la variación de las cepas del complejo de Mycobacterium tuberculosis y su transmisión en países de alta y baja carga de la enfermedad

Abstract

[ES] El genotipado de aislados del complejo de Mycobacterium tuberculosis es una técnica que permite tanto entender la epidemiología y biología del microorganismo como su transmisión. Las micobacterias que pertenecen al complejo Mycobacterium tuberculosis se clasifican en distintos linajes y sublinajes que presentan polimorfismos de nucleótidos únicos (SNPs) que son ideales como marcadores genéticos para caracterizar las cepas procedentes de muestras de aislados clínicos. Existen diversas técnicas de genotipado entre ellas el SNP-typing a tiempo real, que consiste en la realización de PCRs (reacción en cadena de la polimerasa) a tiempo real. La técnica emplea oligos que contienen el SNP característico de un determinado linaje. El análisis posterior de las curvas de fusión del producto de la PCR permite clasificar las muestras determinando la ausencia o presencia del SNP según la temperatura de fusión, técnica conocida como High Resolution Melting (HRM) o análisis de las curvas de fusión. El siguiente trabajo consiste en la determinación del linaje de cepas del complejo de Mycobacterium tuberculosis procedentes de países de alta (Liberia) y baja incidencia (España). Para ello se utilizará un protocolo optimizado para detectar varios linajes en una sola PCR multiplex. Posteriormente, también se va a determinar el sublinaje al que pertenecen las muestras. Además, como cabe la posibilidad de que se hayan dado co-infecciones en los pacientes, se va a tratar de optimizar un método para poder detectarlas.

[EN] Genotyping of Mycobacterium tuberculosis complex isolates allows understanding molecular epidemiology and biology of this microorganism but also how it is transmitted. Mycobacterium tuberculosis complex microorganisms can be classified into different lineages and sublineages, which have characteristic single nucleotide polymorphisms (SNPs). These SNPs can be used as genetic markers to classify Mycobacterium tuberculosis complex strains into phylogenetic lineages. Nowadays, there are a lot of genotyping methods for Mycobacterium tuberculosis complex. One of them is based on SNPs and is called real time SNP-genotyping. This technique consists on real-time PCRs (polymerase chain reaction) using primers containing a specific SNP to recognize the strains that belong to its lineage. Moreover, the High-Resolution Melting (HRM) technique is the one that allows the identification of the SNP and samples classification according to the melting temperature by analyzing the melting curves from the PCR product. This project consists of the classification of different samples coming from high (Liberia) and low (Spain) burden countries into lineages by using real-time SNP genotyping technique. To do that, an optimized multiplex PCR protocol is going to be used to determine different lineage in the same reaction. After that, the identification of strain sublineages is going to be performed. In addition to that, we are going to try to optimize a procedure to detect mixed infections to consider the possibility that the patients have been infected by more than one Mycobacterium tuberculosis strains belonging to different lineages.