Detección de mutaciones en el oncogén BRAF en el tratamiento dirigido frente el cáncer colorrectal

Abstract

[ES] La presencia de mutaciones somáticas en ciertos genes se asocia a la resistencia a los tratamientos con anticuerpos monoclonales dirigidos contra el receptor de crecimiento epidérmico (EGFR), implicado en el desarrollo del cáncer del colorrectal. Un ejemplo de son las mutaciones el gen BRAF, cuyo papel en el cáncer se asocia principalmente con la peor supervivencia de los pacientes afectados. Es por ello que el análisis mutacional de dicho gen es crítico, no sólo para la selección de pacientes candidatos a recibir terapias basadas en inhibidores de EGFR, sino también para pronosticar la enfermedad. A pesar de la amplia oferta de tecnologías disponibles, no se trata de un campo científico-técnico completado, ya que no todos los sistemas sanitarios poseen la capacidad para incorporar muchas de las técnicas existentes, debido principalmente al coste y al tiempo requerido para el análisis. El objetivo de este proyecto es contribuir en el desarrollo de un sistema de análisis mutacional del gen BRAF basado en una tecnología de biosensado alternativa, que presente altas prestaciones de trabajo y de fácil implantación en los laboratorios clínicos. Se seleccionó la mutación c.1799T>A (V600E), ya que es la más frecuente en cáncer colorrectal metastásico y otros tipos de cáncer. Para el enriquecimiento del alelo mutado respecto al nativo, se estudió el empleo de agentes bloqueantes durante la reacción de amplificación. Para la detección de los productos formados, se estudiaron dos métodos post-amplificación: detección mediante fluorescencia y detección colorimétrica basada en hibridación con sondas específicas inmovilizadas en un biochip de policarbonato. El método propuesto permitió disminuir selectivamente la amplificación de los alelos nativos en un rango aproximadamente del 15-22 % y la discriminación de las subpoblaciones en función del perfil de hibridación con elevada reproducibilidad (desviación estándar < 20 %). La metodología se aplicó al análisis mutacional de muestras de tejidos biopsiados embebidos en parafina y fijados en formalina de pacientes con cáncer colorrectal metastásico. Se logró la detección de la mutación en los mismos casos reportados mediante una técnica basada en secuenciación de siguiente generación (NGS, siglas en inglés). Los resultados obtenidos muestran el potencial del método y su capacidad para apoyar el desarrollo de tecnologías alternativas, permitiendo el seguimiento y asesoramiento médico personalizado.

[EN] The presence of somatic mutations in certain oncogenes is associated with resistance to treatments with monoclonal antibodies against epidermal growth factor (EGFR), involved in the development of colorectal cancer. An example of this phenomenon, are mutations present in BRAF oncogene, which role in cancer is mainly associated with the lower survival of affected patients. For this reason, it is critical to perform a mutational analysis of this gene, not only for selection of patients that will benefit from therapies based on inhibition of EGFR, but for establishing the prognosis of the disease. Nevertheless, despite there is a wide offer of available technologies, the scientific-technical field is not completed, so, not all of the sanitary systems have the capacity to incorporate lots of the current techniques, mainly due to the cost and time required for the analysis. The goal of this project is to contribute in the development of a mutational analysis system based on an alternative biosensing technology that offers optimal properties in its performance as its easy implementation in clinical laboratories. It was selected mutation c.1799 T > A (V600E), as it is the most frequent in metastatic colorectal cancer and in other types of cancer. In order to enrich the mutant fraction respect to the wild type, it was studied the use of blocking agents during the amplification reaction (PCR Clamp). For the detection of generated products, there were studied two post-amplification methods: fluorescence detection and colorimetric detection based on a hybridization assay with specific probes in a polycarbonate biochip. The proposed method allowed the selective decrease of amplification of wild type alleles in a range of approximately 15-22 %, as the discrimination of subpopulations due to their hybridization profile with high reproducibility (standard deviation < 20 %). The methodology was applied in mutational analysis of samples from formalin fixed and paraffin embedded biopsy tissues of metastatic colorectal cancer patients. Mutation detection was achieved for the same reported cases by a technique based on next generation sequencing. Obtained results show the potential of the method and will serve to support the development of alternative technologies for monitoring and personalized medical advice for each patient.