Desarrollo de un protocolo rápido de extracción de Polifenoles Oxidasas (PPOs) en berenjena (Solanum melongena)

Abstract

[ES] Las polifenol oxidasas (PPOs) son enzimas que catalizan la oxidación de ácidos fenólicos dando lugar al pardeamiento de frutas y verduras. En los tejidos vegetales, las PPOs y los sustratos fenólicos se encuentran en compartimentos separados, de manera que sólo entran en contacto con una rotura celular dando lugar a las reacciones de pardeamiento. Estos polímeros marrones disminuyen la calidad visual, siendo responsables de importantes pérdidas económicas en el mercado, de ahí la importancia de su evaluación en programas de mejora vegetal dirigidos a aumentar el contenido en polifenoles saludables. La berenjena (Solanum melongena) es una de las hortalizas con mayor contenido en compuestos fenólicos, principalmente ácido clorogénico, que presenta múltiples beneficios para la salud. Sin embargo, este elevado contenido fenólico provoca un rápido pardeamiento de la carne del fruto al contacto con el aire, disminuyendo la calidad aparente de las berenjenas. Hasta ahora, el pardeamiento se estudiaba empleando las técnicas de colorimetría en fruto y de espectrofotometría en zumo de berenjena, pero en estos casos, el pardeamiento se ve influenciado por el contenido natural en ácidos fenólicos que tuviera el fruto. Otros estudios evitan este problema extrayendo las PPOs y midiendo después su actividad, pero para hacerlo parten grandes cantidades de material vegetal. En la práctica, esto dificulta el trabajo de un mejorador y se hace necesario buscar un método que permita partir de poco material vegetal. El objetivo del presente trabajo es conseguir una plataforma de fenotipado adaptada a la mejora genética vegetal. Para ello, se han utilizado 22 accesiones del género Solanum y se han probado tres metodologías: extracción de contenido total de proteínas, obtención de la fracción que contiene las PPOs y la inmunoprecipitación selectiva de PPOs. Además, se han probado 2 sustratos diferentes: 4-metilcatecol y ácido clorogénico. Los resultados obtenidos nos permiten concluir que el protocolo de elección para el estudio de la velocidad de pardeamiento en la berenjena consistiría en extraer el contenido total de proteína partiendo de 50 mg de fruto liofilizado y evaluar la velocidad de pardeamiento empleando como sustrato el ácido clorogénico.

[EN] Polyphenol oxidase (PPO) are enzymes that catalyze the oxidation of phenolic acids causing browning of fruits and vegetables. In plant tissues, PPO and phenolic substrates are in separate compartments, only coming into contact leading to browning reactions after cell disruption. These brown polymers decrease the visual quality, being responsible for significant economic losses in the market, hence the importance of evaluation in plant breeding programs aimed at increasing the content of polyphenols. Eggplant (Solanum melongena) is one of the vegetables with the highest content of phenolic compounds, mainly chlorogenic acid, which has many beneficial effects. However, this high phenolic content causes rapid browning of fruit flesh when it is exposed to oxygen, decreasing the apparent quality of the eggplant. So far, browning studies have been based in the use of colorimetric and spectrophotometric techniques using eggplant fruit juice. In these methods, browning is influenced by the fruit’s natural content in phenolic acids. Other studies avoid this problem by extracting the PPOs and then measuring its activity, but they need large amounts of plant material to do this. This is not practical in plant breeding and it is necessary to develop a method that requires less plant material. The aim of this study is to develop a phenotyping platform adapted to plant breeding. To do so, we used 22 Solanum accessions and tested three extraction methods: extraction of total protein content, obtention of the protein fraction containing PPOs, and selective immunoprecipitation of PPOs; and we tested different substrates: 4-methylcatechol and chlorogenic acid. Our results show that the best protocol for the study of eggplant PPO activity consists in extracting the total protein content from 50 mg of lyophilized fruit material and estimate the rate of browning using chlorogenic acid as substrate.