Expressió heteròloga i caracterització d’una α-glucosidasa d’Aspergillus niger en llevat

Abstract

[CA] Les α-glucosidases són enzims de gran rellevància industrial, per la seva acció en la hidròlisi de maltodextrines derivades del midó. A més, s'ha demostrat la seva capacitat per sintetitzar isomaltooligosacáridos (IMOS), compostos amb propietats prebiòtiques. El grup de recerca on s'ha realitzat aquest treball, havia desenvolupat un sistema per a la producció a gran escala d'un altre compost prebiòtic, en concret el fructo-oligosacàrid (FOS) 6-kestosa, utilitzant un enzim (invertasa) modificada per enginyeria molecular. Un problema de la metodologia emprada és que el producte final del procés conté altes concentracions de sacarosa. L'eliminació de sacarosa d'aquesta barreja no es pot dur a terme mitjançant el tractament amb invertasa ja que aquesta hidrolitza també els FOS d'interès a glucosa i fructosa. En contrast amb això, el mecanisme d'acció de la α-glucosidasa és compatible amb la hidròlisi de sacarosa mentre que la 6-kestosa, en cas de ser substrat, només podria ser hidrolitzada a glucosa i a un disacàrid de fructosa que presumiblement retindria naturalesa prebiòtica . En aquest context, l'objectiu concret d'aquest treball és obtenir un soca de llevat mancada de invertasa i que produeixi una α-glucosidasa extracel·lular per estudiar la seva capacitat d'hidrolitzar selectivament sacarosa respecte a 6- kestosa. Aquesta soca es podria utilitzar per a dur a terme la purificació d'un compost prebiòtic a partir d'una barreja complexa de sacarosa, 6-kestosa, glucosa i fructosa, consumint els sucres que no són d'interès. Per a això, s'han generat diferents construccions gèniques per expressar el gen d'una α-glucosidasa d'Aspergillus niger fusionat a una seqüència senyal de secreció i sota el control de diferents promotors (constitutius o induïbles). Les construccions obtingudes s'han utilitzat per transformar diferents soques de llevat, mancades d'activitat invertasa. S'ha avaluat la viabilitat dels transformants i l'expressió de l’α-glucosidasa, utilitzant un anàleg de substrat cromogènic. Amb un dels transformants obtinguts s'ha dut a terme un estudi comparatiu de la seva capacitat per hidrolitzar maltosa, sacarosa i 6-kestosa, analitzant el perfil de sucres generats després del tractament enzimàtic mitjançant cromatografia d'intercanvi aniònic. A més de la potencial aplicació biotecnològica, aquest estudi proporciona informació bàsica sobre la selectivitat del centre actiu de l' α-glucosidasa d'A. niger per diferents substrats.

[ES] Las α-glucosidasas son enzimas de gran relevancia industrial, por su acción en la hidrólisis de maltodextrinas derivadas del almidón. Además, se ha demostrado su capacidad para sintetizar isomaltooligosacáridos (IMOS), compuestos a con propiedades prebióticas. El grupo de investigación donde se ha realizado este trabajo, había desarrollado un sistema para la producción a gran escala de otro compuesto prebiótico, en concreto el fructo-oligosacárido (FOS) 6-kestosa, utilizando un enzima (invertasa) modificada por ingeniería molecular. un problema de la metodología empleada es que el producto final del proceso contiene altas concentraciones de sacarosa. La eliminación de sacarosa de esta mezcla no puede llevarse a cabo mediante el tratamiento con invertasa ya que ésta hidroliza también los FOS de interés a glucosa y fructosa. En contraste con esto, el mecanismo de acción de la α-glucosidasa es compatible con la hidrólisis de sacarosa mientras que la 6-kestosa, en caso de ser sustrato, sólo podría ser hidrolizada a glucosa y a un disacárido de fructosa que presumiblemente retendría naturaleza prebiótica. En este contexto, el objetivo concreto de este trabajo es obtener una cepa de levadura carente de invertasa y que produzca una α-glucosidasa extracelular para estudiar su capacidad de hidrolizar selectivamente sacarosa respecto a 6-kestosa. Esta cepa se podría utilizar para llevar a cabo la purificación de un compuesto prebiótico a partir de una mezcla compleja de sacarosa, 6-kestosa, glucosa y fructosa, consumiendo los azúcares que no son de interés. Para ello, se han generado distintas construcciones génicas para expresar el gen de una α-glucosidasa de Aspergillus niger fusionado a una secuencia señal de secreción y bajo el control de distintos promotores (constitutivos o inducibles). Las construcciones obtenidas se han utilizado para transformar distintas cepas de levadura, carentes de actividad invertasa. Se ha evaluado la viabilidad de los transformantes y la expresión de la α-glucosidasa, utilizando un análogo de sustrato cromogénico. Con uno de los transformantes obtenidos se ha llevado a cabo un estudio comparativo de su capacidad para hidrolizar maltosa, sacarosa y 6-kestosa, analizando el perfil de azúcares generados tras el tratamiento enzimático mediante cromatografía de intercambio aniónico. Además de la potencial aplicación biotecnológica, este estudio proporciona información básica acerca de la selectividad del centro activo de la α- glucosidasa de A. niger por diferentes sustratos.

[EN] α-Glucosidases are enzymes of great industrial relevance, due to their action in the hydrolysis of maltodextrins derived from starch. In addition, its ability to synthesize isomaltooligosaccharides (IMOS), compounds with prebiotic properties has been demonstrated. The research group where this work was carried out had developed a system for the large-scale production of another prebiotic compound, namely fructo-oligosaccharide (FOS) 6-kestose, using a molecularly engineered enzyme (invertase). A problem of the methodology used is that the final product of the process contains high concentrations of sucrose. Removal of sucrose from this mixture can not be carried out by the treatment with invertase as it also hydrolyzes the FOS of interest to glucose and fructose. In contrast, the mechanism of action of α- glucosidase is compatible with the hydrolysis of sucrose whereas 6-kestose, if it is a substrate, could only be hydrolyzed to glucose and to a fructose disaccharide which would presumably retain prebiotic nature. In this context, the specific objective of this work is to obtain an invertase-free yeast strain and to produce an extracellular α-glucosidase to study its ability to selectively hydrolyze sucrose to 6-kestose. This strain could be used to carry out the purification of a prebiotic compound from a complex mixture of sucrose, 6-kestose, glucose and fructose, consuming the sugars which are not of interest. To this end, different gene constructs have been generated to express the gene of an α-glucosidase from Aspergillus niger fused to a signal secretion sequence and under the control of different promoters (constitutive or inducible). The constructs obtained have been used to transform different strains of yeast, lacking invertase activity. The viability of the transformants and the expression of α-glucosidase, using a chromogenic substrate analogue, have been evaluated. With one of the obtained transformants a comparative study of its capacity to hydrolyze maltose, sucrose and 6-kestose was carried out, analyzing the sugar profile generated after the enzymatic treatment by anion exchange chromatography. In addition to the potential biotechnological application, this study provides basic information about the selectivity of the active center of A. niger α-glucosidase by different substrates.