Desarrollo de materiales enzimáticamente activos basados en una versión recombinante de la β-galactosidasa obtenida a partir de Thermotoga marítima inmovilizada en membranas de celulosa bacteriana

Abstract

[ES] La deficiencia del enzima β-galactosidasa, responsable de la hidrólisis de la lactosa, provoca un desorden alimenticio denominado intolerancia a la lactosa. Actualmente, la industria alimentaria obtiene alimentos sin lactosa mediante la adición directa de este enzima, lo que supone altos costes de producción. En este trabajo, se ha empleado la celulosa bacteriana (BC) como soporte para inmovilizar de forma no covalente el enzima híbrido TmLac-CBM2, en el que se ha fusionado la β-galactosidasa de la T. maritima con el módulo CBM2 de P. furiosus con capacidad de unión a celulosa. En primer lugar, se seleccionó el estado físico del soporte y se evaluó la capacidad de carga del enzima en la celulosa. Posteriormente, se analizó la actividad lactasa del enzima inmovilizado. Además, se estudió la reutilización del soporte celulósico con el enzima unido, encontrando que pierde actividad tras ciclos consecutivos de utilización y lavado. Se determinó que esta pérdida de actividad se debe principalmente a la inactivación de la β- galactosidasa y no al desprendimiento del enzima del soporte celulósico, confirmándose la estabilidad de la unión mediada por el módulo CBM2. Finalmente, se ensayó el efecto de la liofilización sobre la BC con el enzima inmovilizado. Este tratamiento no evitó la pérdida de actividad en ciclos sucesivos de reutilización, pero se observó que la inmovilización tiene un efecto protector sobre la actividad inicial del enzima en el proceso de liofilización. Por tanto, este proceso sería una forma eficaz para facilitar el almacenamiento de la BC con el enzima inmovilizado.

[EN] The deficiency of the enzyme β-galactosidase, responsible for the hydrolysis of lactose, causes a food disorder named lactose intolerance. Currently, food industry produces lactose-free food by the direct addition of this enzyme, involving high production costs. In this work, bacterial cellulose (BC) has been used as a support to immobilize in a non-covalent way the hybrid enzyme TmLac-CBM2, in which the β-galactosidase of T. maritima has been bonded to the CBM2 module of P. furiosus, which has the ability to join cellulose. Firstly, both the physical states of the support and the enzyme loading in cellulose were evaluated. Besides, lactase activity of the immobilized enzyme was analyzed. The reuse of the immobilized enzyme on the cellulosic support was also studied, finding the loss of enzyme activity after consecutive cycles of use and washing. That loss of activity can be explained by the inactivation of the β-galactosidase and not to the release of the enzyme from the cellulosic support. This confirms the immobilization stability facilitated by the CBM2 module. Finally, freeze-drying effect was tested on BC with immobilized enzyme. This treatment did not prevent the loss of activity in consecutive cycles of reuse. However, it was observed a protective effect of the immobilization on the initial enzyme activity during freeze-drying. Therefore, it would be an effective treatment to enable BC storage with the immobilized enzyme.

[CA] La deficiència de l'enzim β-galactosidasa, responsable de la hidròlisis de la lactosa, provoca a les persones que el sofreixen un trastorn alimentari anomenat intolerància a la lactosa (IL). Actualment, la indústria alimentària obté aliments sense lactosa mitjançant l'addició directa d'aquest enzim, la qual cosa suposa elevats costos de producció. En aquest treball, s'ha utilitzat la cel·lulosa bacteriana (BC) com a suport per immobilitzar de forma no covalent l'enzim híbrid TmLac-CBM2, en el que s´ha fusionat la β- galactosidasa de la T. marítima amb el mòdul CBM2 de P. furiosus amb capacitat d´unió a cel·lulosa. En un primer lloc, es va triar l´estat físic del suport i es va avaluar la capacitat de càrrega de l´enzim en la cel·lulosa. Posteriorment, es va analitzar l´activitat lactasa de l´enzim immobilitzat. A més, es va estudiar la reutilització del suport cel·lulòsic de l’enzim unit, trobant que l'enzim perd l'activitat després de cicles consecutius d´utilització í llavat. Es va determinar que la pèrdua d´activitat es deu principalment a la inactivació de la β-galactosidasa i no al despreniment de l´enzim del suport cel·lulòsic, confirmant-se l´estabilitat de la unió mitjançant el mòdul CBM2. Finalment, es va assajar l´efecte de la liofilització sobre la BC amb l´enzim immobilitzat. Aquest tractament no va evitar la pèrdua d´activitat desprès de diversos cicles successius de reutilització, però es va observar que la immobilització té un efecte protector sobre l´activitat inicial de l´enzim en el procés de liofilització. Per tant, aquest procés seria una forma eficaç per facilitar l'emmagatzematge de la BC amb l'enzim immobilitzat.